苜蓿原生质培养及体细胞杂交技术的应用

阐述了植物原生质体培养和体细胞杂交技术以及苜蓿Medicagospp.体细胞胚胎发生特性,综述了该技术在苜蓿育种研究中的应用状况,同时介绍了我国苜蓿研究领域原生质体培养和体细胞杂交技术的研究进展。

大豆组织培养和原生质培养研究的进展

大豆的细胞组织培养 ,在大豆遗传操作的研究中具有重要意义 ,受到国内外极大关注。现在已从大豆下胚轴、子叶、叶、顶芽和花药芽原生质体获得幼苗或植株的报道。但大豆的组织培养中与其他农作物相比在培养过程、成功率、植株再生方面仍较困难。本文对大豆的组织培养、植株再生、原生质体培养、花药培养。

菜心下胚轴原生质体培养和植株再生

以萌发３—４ 天（长约４ ｃｍ ）的菜心（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｖａｒ．ｐａｒａｃｈｉｎｅｓｉｓ）无菌苗苍白下胚轴为材料，酶解分离原生质体。经纯化的原生质体，在含０．５ ｍ ｇ／ＬＺＴ、０．５ ｍ ｇ／Ｌ２，４－Ｄ、１．０ ｍ ｇ／ＬＮＡＡ 和０．４ ｍ ｏｌ／Ｌ葡萄糖的Ｋ８ｐ 培养基中，进行微滴培养。在起始培养１４—１８小时，原生质体再生新的细胞壁。３６ 小时再生细胞开始第一次分裂。第三天分裂细胞频率可达３５％ 。培养第８—９ 天，可见含８—１６个细胞的小细胞团，植板率为１５％ —１８％ 。３ 周后将发育成直径为２ ｍ ｍ 的白色小愈伤组织，转到含０．３ ｍ ｇ／Ｌ ２，４－Ｄ并用ｇｅｌｒｉｔｅ半固化的培养基上，增殖成４—５ ｍ ｍ 直径的愈伤组织。在ＭＳ＋ ３．２（或１．６） ｍ ｇ／Ｌ ＢＡ＋ １．６（或０．８） ｍ ｇ／ＬＺＴ＋ ０．０１ ｍ ｇ／Ｌ ＮＡＡ＋ ０．１ ｍ ｇ／ＬＧＡ３ 和０．２％ 蔗糖的分化培养基上，获得芽的分化。切下约２ ｃｍ 长的芽苗，转移到含０．２ ｍ ｇ／ＬＩＡＡ 和２％ 蔗糖的培养基上。

野生黄花苜蓿叶肉原生质体培养和植株再生

取野生黄花苜蓿15～20天叶龄的叶片，去掉下表皮，用1％纤维素酶、1％半纤维素酶和0．5％果胶酶的混合液游离原生质体。用改良的MS培养基附加2，4－D、BA和NAA等，在黑暗条件下浅层悬浮培养。培养第4天、第7天和第10天，原生质体分别出现第一次、第二次和多次分裂，在此期间数次加液或换液调节渗透压，直至形成1mm左右的大细胞团，然后转移到附加2，4-D和KT等的MS固体培养基，诱导形成愈伤组织，再经4～5次继代培养，分化成为完整的再生植株。

不结球白菜子叶原生质体培养再生植株

用 1 0g/ 10 0mL纤维素酶 (OnozukaR 10 ) ,0 1g/ 10 0mL果胶酶 (MecerozymeR 10 )及 10mmol/LCaCl2 ·2H2 O ,0 7mmol/LKH2 PO4 和 0 5mol/L甘露醇的混合酶液 ,从 14～ 18d苗龄的不结球白菜子叶上分离出高产率的原生质体。原生质体培养在KM8P1附加 2 ,4 D 0 5mg/L、 6 BA 0 2 5mg/L、NAA 0 5mg/L、葡萄糖 9 0g/ 10 0mL、蔗糖 1 0g/ 10 0mL、半乳糖0 0 3g/ 10 0mL液体培养基上 ,分裂旺盛。形成愈伤组织后经芽诱导和生根培养 ,获得了再生植株。

草地早熟禾新格莱德胚性愈伤组织原生质体培养及植株再生的研究

以草地早熟禾品种——新格莱德成熟种子为供试材料,在含3.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）0、.5 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）的MB5培养基中进行胚性愈伤组织诱导的培养。并从生长了7-9个月的胚性愈伤组织中分离出原生质体,将该原生质体置于KM8P培养基（含3.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1%蔗糖0、.4 mol/L甘露醇）中进行了液体浅层培养。结果表明,新格莱德原生质体在上述KM8P培养基中培养3 d后出现第1次细胞分裂,2-3周后形成小细胞团,此时添加低渗培养液2-3次,小细胞团持续分裂并形成愈伤组织。当愈伤组织块长至3-5 mm时,转入固体培养基MS＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L6-BA和MS＋0.5 mg/L萘乙酸（NAA）＋5.0 mg/L 6-BA上进行培养,使其细胞增殖和分化,且逐步形成完整的植株。

土人参原生质体培养再生植株

分别由土人参（Ｔａｌｉｎｕｍ ｐａｎｉｃｕｌａｔｕｍ （Ｊａｅｑ．） Ｇａｅｒｔｎ．）组织培养再生苗的叶片和幼茎诱导的愈伤组织游离出原生质体．叶肉原生质体在培养中未能进行正常分裂，存活不过１ 周．愈伤组织原生质体在Ｐ４ 培养基中（Ｋ８ｐ＋ ２，４－Ｄ ０．２ ｍ ｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ １．０ ｍ ｇ／Ｌ＋ ＺＴ ０．５ ｍ ｇ／Ｌ＋椰乳５０ ｍ Ｌ／Ｌ＋ 葡萄糖０．５ ｍ ｏｌ／Ｌ）培养３ ｄ 开始第一次分裂，培养７ ｄ 时分裂频率为３６．７％ ． 愈伤组织再生率在液体培养中为０．３１％ ，在双层培养中为０．３４％ ． 愈伤组织在含有较低浓度的６－ＢＡ 的分化培养基上分化出不定芽． 幼苗生根后移栽到花盆中继续生长，２～３个月后开花结实，长出粗壮的肉质根． 再生小植株在试管中继代培养２～３ 个月开花结实． 研究结果还表明∶（１）愈伤组织在液体培养基或增殖培养基中培养时间过长，或继代次数过多均不利于分化．（２）较低浓度的６－ＢＡ （０．５～０．７ ｍ ｇ／Ｌ）对愈伤组织的分化是合适的．（３）ＧＡ３ 对幼苗的发育有促进作用．

美味猕猴桃原生质体培养及植株再生技术研究

以美味猕猴桃雄株茎段愈伤组织为材料，分离原生质体，并培养在ＫＭ８Ｐ附加０．４５ｍｏｌ／Ｌ葡萄糖和０．０５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的培养基上，用低熔点琼脂糖包埋，６～７ｄ发生第一次细胞分裂，培养２０ｄ的分裂频率为１１．３％．在未添加新鲜培养液的情况下，原生质体再生的细胞可持续分裂至８０ｄ左右，并形成２～３ｍｍ大小的愈伤组织．然后采用二步诱导分化法将原生质体来源的愈伤组织诱导分化出绿苗，再诱导生根，形成完整的小植株．

沙打旺胚性原生质体培养优化及高频再生植株

外植体类型和光照条件决定沙打旺胚性愈伤组织的形成。用生长10d的胚性愈伤组织可分离到12×106个/g(原生质体/细胞),活力超过80%。当原生质体以10×105/mL的植板密度培养在含06%琼脂糖附加15mg/L2,4D、05mg/LBA和05mol/L葡萄糖的培养基(无机盐降为1/4)中,植板率为168%。条件培养基显著促进原生质体的生长发育。长大的细胞克隆经2周4℃低温处理后转到含01mg/LNAA和10mg/LBA分化培养基上,体细胞胚胎发生频率高达70%,每克细胞产生的体细胞胚数在200个以上。成熟的体细胞胚转到无激素的1/2MS培养基中即分化成苗,再生植株为正常的二倍体。

沙打旺原生质体培养再生植株

用1%半纤维素酶,0.4%纤维素酶,0.1%果胶离析酶,CPW9M酶液分离沙打旺无菌苗下胚轴和子叶原生质体。K8P原生质体培养基悬滴培养。下胚轴原生质体形成小细胞团后用琼脂糖包埋培养,形成小块愈伤组织后转入增殖培养基M1、M2(改良MS培养基)上形成大块愈伤组织。经过两次诱导分化,在分化培养基M3(MS+0.7mg/L BA+0.2mg/L NAA),M4(MS+0.5mg/L BA+0.5mg/L KT+0.5mg/L ZT+0.2mg/L NAA)和M6(MS+3mg/L ZT+0.2mg/L IAA)上分化出苗,再生植株。由子叶分离的原生质体未能形成愈伤组织。

紫花苜蓿原生质体培养与植株再生

由和田苜蓿和单选苜蓿叶肉分离原生质体，采用改良的K8P和MS培养基进行液体浅层培养。原生质体经一次分裂，二次分裂和多次分裂，形成小细胞团，并很快长成小愈伤组织。愈伤组织在MS分化培养基上增殖并分化，产生小植株，经MS无激素培养基生根形成完整的再生植株。

不结球白菜OguCMS下胚轴原生质体培养再生植株

取不结球白菜OguCMS 5d苗龄的下胚轴 ,在 2 0mg/mL纤维素酶 (OnozukaR 10 ) ,10mg/mL果胶酶 (MecerozymeR 10 )及CaCl2 ·2H2 O 10mmol/L、KH2 PO4 0 .7mmol/L、甘露醇 0 .5mol/L的酶液中游离 36h ,50 0r/min下离心收集下胚轴原生质体。原生质体在KM8P1附加 2 ,4 D 0 .5mg/L、 6 BA 0 .2 5mg/L、NAA 1.0mg/L的培养基上培养 2 1d形成小愈伤组织 ,经MS附加 2 ,4 D 1.0mg/L增殖愈伤组织 ,在MS附加 6 BA 10 .0mg/L和NAA 0 .3mg/L培养基上进行芽分化培养 ,并在无任何激素的MS培养基上生根 ,14d后即可获得完整的再生植株。

植物内源激素对原生质体培养的影响

以烟草试管苗叶，美味猕猴桃、毛花猕猴桃子叶愈伤组织以及玉米叶片为材料，进行了内源激素水平的测定和原生质体培养的研究．结果表明：高水平内源玉米素核苷（ZR）含量和高ZR与吲唑乙酸（IAA）质量比有利于原生质体再生细胞的分裂；高水平内源脱落酸（ABA）对再生细胞分裂有抑制作用．内源IAA，ZR和ABA含量对原生质体培养的影响在不同种之间存在差异．

结球甘蓝下胚轴原生质体培养再生植株体系的优化研究

以结球甘蓝‘新夏50’的无菌苗下胚轴为材料,对影响原生质体分离、纯化与培养的主要因素进行研究,建立适合结球甘蓝原生质体游离、纯化、收集、培养以至再生出完整植株的实用技术体系,为其非对称细胞融合及品种改良与创新等研究奠定基础。结果表明:2.5%纤维素酶R-10+0.05%果胶酶Y-23+9CPW+5mmol/L MES的混合酶液,从4d苗龄的下胚轴上分离出高产率的原生质体。在改良B5+0.5mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA的液体培养基上,原生质体分裂旺盛。形成愈伤组织后经芽诱导和生根培养,获得了再生植株。倍性检测结果表明,不同原生质体所获得的24株再生植株中,19株为正常二倍体,4株为嵌合体,1株为四倍体。

草莓原生质体的培养和植株再生

通过对已分离提纯的草莓原生质体的培养研究 ,比较得出以KM为培养基 ,以 0 .4mol L葡萄糖和 0 .1mol L蔗糖或仅以 0 .5mol L葡萄糖作碳源 ,采用低溶点琼脂糖包埋的培养方式 ,培养密度采用 1× 10 6个 mL ,原生质体出现分裂和小愈伤组织形成的时间都较早。以MS1 、MS2 、MS3 为培养基、采用分步诱导的方法 ,能顺利诱导产生新植株 。

霸王的原生质体培养及植株再生研究

本研究建立了霸王原生质体再生植株的试验体系。以子叶切块诱导的松软愈伤组织为材料,通过酶法分离出大量有活力的原生质体,原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织,并分化出再生苗。比较了不同培养基和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明,原生质体以2×105个/mL的植板密度,采用液体浅层法培养在附加1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.2 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.2 mg/L激动素(KT)、500 mg/L水解酪蛋白(CH)、2%蔗糖和0.5 mol/L甘露醇的DPD培养基中,可获得最佳效果,其细胞分裂频率达28.4%左右。转移到附加1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L萘乙酸(NAA)的MS分化培养基上,获得大量的再生苗。

草地早熟禾原生质体培养与融合

以草地早熟禾品种RugbyⅡ成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,以酶解法分离出原生质体,进行了原生质体培养;利用PEG融合法对MidnightⅡ和Nuglade的原生质体进行了融合,获得了体细胞杂种愈伤组织。研究了不同酶液组成、酶解时间、愈伤组织继代时间和渗透压对草地早熟禾原生质体游离及生长的影响;预处理对亲本原生质体活力的影响和适宜的融合条件。结果表明:采用继代培养8～10d的胚性愈伤组织,在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14～17h可得到产量和活力较高的原生质体;原生质体在KM8P培养基中培养3d后出现第1次细胞分裂,2～3周后形成小细胞团,此时添换低渗培养基2～3次,有利于小细胞团持续分裂并形成愈伤组织;试验获得了草地早熟禾品种RugbyⅡ原生质体来源的愈伤组织;5mmol/ml碘乙酰胺处理Nuglade原生质体10min及40μg/ml罗丹明处理MidnightⅡ原生质体5min,能有效地使Nuglade和MidnightⅡ原生质体失活;两品种融合PEG(6000)适宜浓度35%,融合率为9.8%。

铁皮石斛叶肉原生质体的分离与培养研究

对铁皮石斛无菌试管苗叶片原生质体的游离及培养条件进行了研究.结果表明原生质体分离的适宜酶液配比是0.5%Pectinase和1.0%CellulaseOnozukaR-10,渗透压调节剂的浓度为0.5mol/L,以蔗糖作为渗透压调节剂优于甘露醇和葡萄糖,质壁分离处理后的叶片原生质体产量提高了16.6%,存活率提高了14.2%.培养在1/10MS附加2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA和多种有机成分培养基上的铁皮石斛无菌苗叶片原生质体,3～5d后开始第一次分裂,30d后长成胚性细胞团.弱光照(1501x)和稍低的温度((21±0.5)℃)适于原生质体的培养.

陆地棉原生质体培养与植株再生技术研究

分离培养陆地棉品种ZDM-3(Gossypium hirsutum LcvZDM-3)胚性细胞悬浮系的原生质体,通过体细胞胚胎发生成功获得再生植株。试验结果表明,植物生长调节剂组合和碳源对原生质体培养具有重要的影响,添加2,4-D+KT+1.5%(W/V)葡萄糖+1.5%(W/V)麦芽糖的KM8P培养基对于陆地棉原生质体培养的效果较好。激素组合0.46μmol·L-1KT+0.45μmol·L-12,4-D诱导的愈伤组织较松软,分化潜力高;胚性愈伤组织的增殖使用0.93μmol·L-1KT+2.46μmol·L-1IBA的激素组合;1.2μmol·L-1IBA+1.39μmol.L-1KT有利于体细胞胚胎发生,而MSB5+0.67μmol·L-1KT+2.69μmol·L-1NAA的培养基适合体细胞胚胎萌发和植株再生。此外,愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源,而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源。