目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白中的作用,及新型过氧化物酶Peroxiredoxin-1(Prx-1)对该作用的影响。方法体外培养肺成纤维细胞随机分为4组:对照组(0.4%血清)...目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白中的作用,及新型过氧化物酶Peroxiredoxin-1(Prx-1)对该作用的影响。方法体外培养肺成纤维细胞随机分为4组:对照组(0.4%血清)、TGF-β1组(5μg/L)、阴性转染组(TGF-β1+阴性对照si RNA)和Prx-1 si RNA转染组(TGF-β1+Prx-1 si RNA)。采用脂质体转染法转染si RNA,实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后Prx-1 m RNA表达;Western blot检测Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ERK1/2及Prx-1表达;2,7-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平。结果 Prx-1 si RNA转染肺成纤维细胞后,Prx-1 m RNA表达明显降低,最大抑制率为92%。与对照组比较,TGF-β1组的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ROS、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)及Prx-1蛋白的表达水平均明显提高。与TGF-β1组比较,阴性转染组中的上述观察指标无明显变化,但Prx-1转染组的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ROS、p-ERK1/2水平进一步提高,而Prx-1蛋白的表达被抑制。结论 TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成ROS,并促进ERK1/2通路的激活,导致Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成增加,而Prx-1 si RNA可通过提高ROS水平进一步促进TGF-β1该作用。展开更多
目的:在大肠杆菌中重组表达贝类主要过敏原—原肌球蛋白(Pen a 1),并且评估其IgE结合活性。方法:首先基于Pen a 1的已知序列人工合成Pen a 1基因,其次将其与质粒pET-28a连接以构建重组表达质粒pET-28a(+)-Pen a 1,经测序、酶切鉴定后导...目的:在大肠杆菌中重组表达贝类主要过敏原—原肌球蛋白(Pen a 1),并且评估其IgE结合活性。方法:首先基于Pen a 1的已知序列人工合成Pen a 1基因,其次将其与质粒pET-28a连接以构建重组表达质粒pET-28a(+)-Pen a 1,经测序、酶切鉴定后导入表达宿主E.coli BL21(DE3)细胞中。通过IPTG诱导,重组表达Pen a 1蛋白,镍柱纯化表达产物,并采用SDS-PAGE电泳及质谱技术鉴定所得重组蛋白。最后应用贝类过敏患者采用LICA技术检测该重组蛋白的IgE结合活性。结果:PCR结果表明,目的基因全长为930 bp,与理论预测值一致。SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白在宿主菌内以可溶性蛋白的形式高效表达,分子量约为36 kD,大小与理论值相符。质谱鉴定结果进一步说明所得的重组蛋白为原肌球蛋白Pen a 1。免疫分析结果表明该蛋白具有较高的IgE结合能力。结论:成功表达、纯化出有良好免疫学活性的重组原肌球蛋白Pen a 1,为进一步研究Pen a 1在贝类动物如虾类过敏的诊断和治疗中作用奠定基础。展开更多
文摘目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白中的作用,及新型过氧化物酶Peroxiredoxin-1(Prx-1)对该作用的影响。方法体外培养肺成纤维细胞随机分为4组:对照组(0.4%血清)、TGF-β1组(5μg/L)、阴性转染组(TGF-β1+阴性对照si RNA)和Prx-1 si RNA转染组(TGF-β1+Prx-1 si RNA)。采用脂质体转染法转染si RNA,实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后Prx-1 m RNA表达;Western blot检测Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ERK1/2及Prx-1表达;2,7-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平。结果 Prx-1 si RNA转染肺成纤维细胞后,Prx-1 m RNA表达明显降低,最大抑制率为92%。与对照组比较,TGF-β1组的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ROS、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)及Prx-1蛋白的表达水平均明显提高。与TGF-β1组比较,阴性转染组中的上述观察指标无明显变化,但Prx-1转染组的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、ROS、p-ERK1/2水平进一步提高,而Prx-1蛋白的表达被抑制。结论 TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成ROS,并促进ERK1/2通路的激活,导致Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成增加,而Prx-1 si RNA可通过提高ROS水平进一步促进TGF-β1该作用。
文摘目的:在大肠杆菌中重组表达贝类主要过敏原—原肌球蛋白(Pen a 1),并且评估其IgE结合活性。方法:首先基于Pen a 1的已知序列人工合成Pen a 1基因,其次将其与质粒pET-28a连接以构建重组表达质粒pET-28a(+)-Pen a 1,经测序、酶切鉴定后导入表达宿主E.coli BL21(DE3)细胞中。通过IPTG诱导,重组表达Pen a 1蛋白,镍柱纯化表达产物,并采用SDS-PAGE电泳及质谱技术鉴定所得重组蛋白。最后应用贝类过敏患者采用LICA技术检测该重组蛋白的IgE结合活性。结果:PCR结果表明,目的基因全长为930 bp,与理论预测值一致。SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白在宿主菌内以可溶性蛋白的形式高效表达,分子量约为36 kD,大小与理论值相符。质谱鉴定结果进一步说明所得的重组蛋白为原肌球蛋白Pen a 1。免疫分析结果表明该蛋白具有较高的IgE结合能力。结论:成功表达、纯化出有良好免疫学活性的重组原肌球蛋白Pen a 1,为进一步研究Pen a 1在贝类动物如虾类过敏的诊断和治疗中作用奠定基础。
基金the Research and Development Projects of Shenzhen,No.JCYJ20130402114702130the Program of Shenzhen Municipal Science and Technology Bureau,No.201302064~~
