原肌球蛋白4通过慢病毒重组体技术应用于脊髓损伤后的作用及机制研究:随机对照实验方案

背景:前期研究采用2-DE/MALDI-TOF/MS方法,发现原肌球蛋白4在脊髓表达增加,但迄今为止,有关原肌球蛋白4与脊髓损伤的发病机制和进展的关系仍知之甚少。方法/设计:(1)随机对照动物实验:建立脊髓全横断损伤大鼠模型,通过2-DE双向电泳、氨基酸系列分析、q-PCR和Western-Blot方法明确脊髓横断损伤3-28 d在损伤脊髓头侧原肌球蛋白4的表达变化。(2)基因水平的机制探索实验:用基于体外慢病毒重组体技术敲除原肌球蛋白4,研究其对体外培养的脊髓神经元树突生长长度的作用;并通过BBB评分法评估原肌球蛋白4敲除对脊髓横断损伤大鼠运动功能恢复的作用。讨论:实验结果拟为脊髓横断损伤后促进运动功能恢复的治疗提供一种基于慢病毒重组体为载体携带原肌球蛋白4干扰RNA的、新的、有效的分子治疗策略,并阐明其治疗作用机制,为临床脊髓全横断损伤的基因治疗开辟乐观的应用前景。伦理批准:研究经昆明医科大学医学伦理委员会批准,大鼠的外科操作和术后护理遵循中国实验动物保护和伦理委员会的规定,并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。

大鼠脊髓损伤对IL-10和原肌球蛋白4在脊髓中表达的影响

目的:探讨脊髓顿挫伤(spinal cord contusion,SCC)后白细胞介素10(IL-10)和原肌球蛋白4(TPM4)在脊髓中的表达变化。方法:成年健康雌性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham)和脊髓顿挫伤组(SCC)。用Allen’s打击法建立脊髓顿挫损伤模型,BBB评分评价大鼠运动功能变化;免疫组织化学技术分别显示IL-10和TPM4在脊髓组织的定位情况;并利用q-PCR检测两者的mRNA含量变化。结果:BBB评分结果表明SCC组大鼠运动功能明显障碍,但损伤后7 d(P<0.05)、14 d(P<0.001)和28 d(P<0.001)组逐渐得到改善。免疫组化结果显示,IL-10主要定位于脊髓白质神经胶质细胞的胞体和突起,第28 d在血管内皮细胞也有少量表达。TPM4主要定位于神经元和胶质细胞质和突起。q-PCR结果显示,大鼠术后IL-10 mRNA表达在第1d组明显增加(P<0.001),而后逐渐下降到Sham组水平。TPM4 mRNA含量在损伤后第7 d(P<0.05)明显降低,后又逐渐上升。结论:脊髓损伤早期,IL-10表达增高可抑制脊髓组织的炎症反应,从而减轻组织损伤。而脊髓损伤后期TPM4表达升高可能与神经元修复有关。

原肌球蛋白4在胃癌细胞迁移、侵袭和转移中的作用

目的:探索原肌球蛋白4(Tropomyosin4,TPM4)在胃癌细胞的迁移、侵袭和转移中的作用。方法:利用Real-time PCR、Western Blot及免疫荧光,检测原肌球蛋白4在不同胃癌细胞系及正常胃上皮细胞中的表达情况;利用免疫组化,检测原肌球蛋白4在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况;利用慢病毒技术,在GC9811-P细胞中,分别转染LV-TPM4、shRNA-TPM4及对照空载体;通过Transwell和体内实验,检测胃癌细胞迁移、侵袭和转移。结果:Real-time PCR、Western Blot及免疫组化结果显示,原肌球蛋白4在胃癌细胞系及胃癌组织中的表达降低;上调原肌球蛋白4的表达后,抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和转移;下调原肌球蛋白4的表达后,促进胃癌细胞的迁移、侵袭和转移(P<0.05)。结论:原肌球蛋白4抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和转移。

原肌球蛋白-4联合CEA、CA19-9在结肠癌中的表达及其临床意义

目的探究原肌球蛋白-4(tropomyosin-4,Tm-4)联合癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、癌抗原19-9(cancer antigen 19-9,CA19-9)在结肠癌中的表达及临床意义。方法收集我院确诊结肠癌100例为病例组,收取100例结肠良性疾病为良性病变组,同期收取在我院的健康人群100例为对照组。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清Tm-4;采用化学发光法分别检测血清CEA与CA19-9水平。结果单因素方差分析结果显示,三组间血清Tm-4、CEA和CA19-9水平差异均具有统计学意义(P <0. 05)。组间比较显示,病例组的血清Tm-4、CEA和CA19-9水平均显著高于良性病变组和对照组,差异具有统计学意义(P <0·05)。血清Tm-4、CEA和CA19-9水平与结肠癌分期(Tm-4:r=0.567,P=0.002;CEA:r=0.552,P=0.006;CA19-9:r=0.535,P=0.011)、组织学类型(Tm-4:r=0.559,P=0.001;CEA:r=0.539,P=0.007;CA19-9:r=0.538, P=0.017)及分化程度(Tm-4:r=0.514,P=0.006;CEA:r=0.501,P=0.018;CA19-9:r=0.497,P=0.023)呈线性关联,且Tm-4、CEA和CA19-9在中晚期结肠癌、未分化癌及低分化结肠癌患者中的水平增高最显著。受试者工作特征曲线显示,联合Tm-4、CEA和CA19-9区分结肠癌与良性病变组和对照组的灵敏度/特异性为88.1%/93.4%。相比低Tm-4组,高Tm-4组患者的生存时间显著缩短(χ~2=13.929,P<0.001);相比低CEA组,高CEA组患者的生存时间显著缩短(X^2=10.157,P=0.001);相比低CA19-9组,高CA19-9组患者的生存时间显著缩短(χ~2=4.364,P=0.037)。结论联合血清Tm-4、CEA和CA19-9对结肠癌具有诊断及预后评估价值,且与结肠癌分期、组织学类型、分化程度显著相关。

孕早期超声NT联合母体APOC1、TPM4对胎儿心脏畸形的早期诊断价值分析

目的:探讨孕早期超声NT联合母体APOC1、TPM4对胎儿心脏畸形的早期诊断价值。方法:选取2021年1月1日—2022年1月1日入我院分娩的孕妇100例作为观察对象,以超声心动图检测胎儿是否存在心脏畸形为金标准将患者分为对照组和观察组。对照组为无胎儿心脏畸形44例,观察组则为胎儿心脏畸形56例,采用孕早期超声检测NT厚度,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清中APOC1、TPM4蛋白表达水平,采用Pearson分析NT与APOC1、TPM4相关性,ROC分析NT与APOC1、TPM4对胎儿心脏畸形的早期诊断价值。结果:相比于对照组,观察组孕11周、12周及13周时期的胎儿NT值均增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,观察组APOC1表达增加,TPM4表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);NT与APOC1呈现正相关性(r=0.856,P<0.001),NT与TPM4呈现负相关性(r=-0.775,P<0.001);NT参数、APOC1、TPM4联合诊断胎儿心脏畸形的曲线下面积最大,为0.890,敏感度为89.40%、特异度为87.20%。结论:胎儿心脏畸形的母体中NT厚度增加,APOC1升高,TPM4降低,采用NT参数、APOC1、TPM4联合诊断可显著提高胎儿心脏畸形的早期诊断,值得推广应用。

孕早期胎儿脐静脉导管彩色多普勒超声血流频谱参数结合血清蛋白测定在先天性心脏畸形中的诊断价值及与胎儿染色体异常关系

目的探讨孕早期胎儿脐静脉导管(umbilical venous catheter,UVC)彩色多普勒超声血流频谱参数结合载脂蛋白C1(apolipoprotein C-1,APOC1)、原肌球蛋白4(tropomyosin 4,TPM4)、核纤层蛋白A(lamin A,LMNA)蛋白测定在先天性心脏畸形(congenital heart disease,CHD)中的诊断价值及与胎儿染色体异常关系。方法选取2017年12月至2020年1月河北省唐山市妇幼保健院收治的72例诊断为CHD胎儿的孕妇作为观察组,另选取胎儿正常的孕妇72例作为对照组。比较分析两组UVC彩色多普勒超声血流频谱参数[包括心室收缩期速度(S)、心室舒张期峰值速度(D)、心房收缩期峰值速度(A)、A波最大速度(TA_(max))、搏动指数(pulsatility index,PI)、静脉前负荷指数(preload index,PLI)、静脉峰值流速指数(peak velocity index vein,PVIV)]及APOC1、TPM4、LMNA蛋白表达情况,分析血流频谱参数与各蛋白表达相关性及二者联合对CHD的诊断价值,并分析血流频谱参数及各蛋白表达与CHD胎儿染色体异常的关系。结果观察组UVC彩色多普勒超声血流频谱参数S、D、A、TA_(max)、TPM4及LMNA蛋白表达水平均低于对照组,PI、PLI、PVIV及APOC1蛋白表达水平高于对照组,差异有显著性(P<0.05);观察组APOC1蛋白表达与UVC彩色多普勒超声血流频谱参数S、D、A、TA_(max)呈负相关,与PI、PLI、PVIV呈正相关,TPM4、LMNA蛋白表达与UVC彩色多普勒超声血流频谱参数S、D、A、TA_(max)呈正相关,与PI、PLI、PVIV呈负相关(P<0.05);受试者工作特征曲线分析显示,UVC彩色多普勒超声血流频谱参数、各蛋白表达联合诊断CHD的曲线下面积最大,为0.852。观察组染色体异常率高于对照组,差异有显著性(P<0.05);CHD染色体异常胎儿UVC彩色多普勒超声血流频谱参数S、D、A、TA_(max)、TPM4及LMNA蛋白表达水平均低于染色体正常胎儿,PI、PLI、PVIV及APOC1蛋白表达高于染色体正常胎儿,差异有显著性(P<0.05);Logistic回归分析显示,UVC彩色多普勒超声血流频谱参数(S、D、A、TA_(max)、PI、PLI、PVIV)、APOC1、TPM4、LMNA蛋白表达均与CHD胎儿染色体异常有关(P<0.05)。结论UVC彩色多普勒超声血流频谱参数联合APOC1、TPM4、LMNA蛋白测定可提高CHD产前诊断的诊断价值,且二者均与CHD胎儿染色体异常有关,可作为染色体异常早期筛查诊断指标。

siRNATPM4对肺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨原肌球蛋白(TPM)4小干扰RNA(siRNA TPM4)对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法以人肺癌细胞A549为研究对象,细胞转染TPM4 siRNA(TPM4 siRNA组)、siRNA control(siRNA control组),同时设置对照组,对照组中只加入转染试剂。培养48 h后,Western印迹检测细胞TPM4、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 siRNA control组细胞中TPM4、Cleaved Caspase-3、Bcl-2表达水平及细胞存活率、细胞凋亡率与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。TPM4 siRNA组细胞中TPM4表达水平及细胞存活率均明显低于对照组(P<0.01)。TPM4 siRNA组细胞中Cleaved Caspase-3表达水平及细胞凋亡率均明显高于对照组,而Bcl-2明显低于对照组(P<0.01)。结论 TPM4 siRNA能够抑制肺癌细胞增殖,促进肺癌细胞凋亡。

TPM4在胃癌细胞中的表达及其对胃癌细胞侵袭与迁移能力的影响

目的观察原肌球蛋白4(tropomyosin 4,TPM4)在胃癌细胞中表达及其对胃癌细胞的侵袭与迁移能力的影响.方法用Transwell小室分离法培养高迁移性胃癌细胞与非迁移性胃癌细胞亚系,分别命名为SGC7901-invasion细胞、SGC7901-noninvasion细胞,提取两株细胞的RNA并测序.qRT-PCR及Western blot分别检测两株细胞中TPM4的表达水平.另外转染TPM4-siRNA于SGC7901-invasion细胞,干扰TPM4表达,用Transwell实验及细胞划痕实验检测TPM4对SGC7901-invasion细胞侵袭与迁移能力的影响.结果RNA测序结果显示,TPM4在SGC7901-invasion细胞中表达量是SGC7901-noninvasion细胞的3.08倍(P<0.05).qRT-PCR和Western blot结果显示,与SGC7901-noninvasion细胞相比,在SGC7901-invasion细胞中TPM4的表达显著增高(P<0.05).转染TPM4-siRNA可明显抑制SGC7901-invasion细胞中TPM4的表达.Transwell实验结果显示,干扰TPM4表达可抑制SGC7901-invasion细胞的侵袭(P<0.05).细胞划痕实验结果显示,干扰TPM4的表达可抑制SGC7901-invasion细胞的迁移(P<0.05).结论TPM4在SGC7901-invasion细胞中高表达.TPM4可促进GC7901-invasion细胞侵袭与迁移.

TPM4对人胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨原肌球蛋白4(TPM4)对人胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响。方法 采用qRT-PCR检测人正常胰腺导管上皮细胞(HPDE)和人胰腺癌细胞系(ASPC-1、BXPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、SW1990)中TPM4 RNA表达量。采用siRNA或过表达慢病毒感染胰腺癌细胞(MIA PaCa-2、PANC-1),通过qRT-PCR、Western blotting检测各组细胞TPM4的表达,划痕实验及Transwell实验检测各组胰腺癌细胞侵袭和迁移能力。结果 GEPIA数据库中胰腺癌组织TPM4表达明显高于正常胰腺组织(P<0.05),qRT-PCR分析TPM4 RNA在胰腺癌细胞系中表达均高于HPDE(P<0.0001)。与对照组相比,在MIA Paca-2和PANC-1中过表达TPM4促进了胰腺癌细胞侵袭迁移能力(均P<0.01),而敲低TPM4胰腺癌细胞侵袭迁移能力则明显减弱(均P<0.01)。结论 TPM4在胰腺癌细胞中呈现高水平表达,可能在胰腺癌中发挥着癌基因的作用,其并可促进胰腺癌细胞迁移及侵袭能力。

大尺度PCR:不依赖大小的产物合成

大尺度ＰＣＲ：不依赖大小的产物合成大尺度ＰＣＲ已被用来制做原肌球蛋白４（ＴＭＰ４）的一个探针。已经发现至少３个ＴＭＰ４假基因的存在并不抑制长达４．５ｋｂ基因产物的合成。原肌球蛋白是肌细胞（骨骼肌、心肌和平滑肌）及非肌细胞中一族高度相关联的杆类蛋白。经...