去上皮羊膜在翼状胬肉手术中的应用

目的 :观察羊膜在治疗翼状胬肉中起治疗作用的组织成分。方法 :随机选取翼状胬肉的患者分为 3组 ,分别为手术组 ,手术加羊膜移植和手术加去上皮羊膜覆盖组。术后随访 6～ 18个月 ,观察比较各组的治疗效果。结果 :发现各组治愈率、复发率随时间延长而明显不同。结论 :去上皮羊膜的细胞外基质成分在治疗翼状胬肉中起主要作用。

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块+细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。

体外培养角膜缘干细胞重建眼表的实验研究

目的探讨以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞移植片治疗碱烧伤兔动物模型的效果。方法应用印迹细胞学方法选取完全性角膜缘干细胞缺陷的兔眼碱烧伤模型,另眼取材通过组织块联合酶消化法对角膜缘干细胞进行体外培养,鼠单克隆抗体AE5对其进行免疫细胞化学染色鉴定。对碱烧伤兔眼行植片移植,观察术后眼表状态变化。结果体外培养的兔角膜缘细胞在去上皮羊膜上生长良好,形成复层,AE5细胞免疫鉴定呈强阳性。不同移植片治疗碱烧伤兔眼,以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植组和同种异体移植组,术后角膜病变总评分与去上皮羊膜移植组和对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植与同种异体移植在兔眼碱烧伤模型的眼表重建方面均显示出良好的效果。

恒河猴骨髓间充质干细胞在体外向角膜上皮前体细胞的诱导分化

组织工程生物角膜是角膜的理想替代物,为严重眼表疾病的治疗带来了希望.然而,足量种子细胞的获得是构建生物角膜的瓶颈.骨髓间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能.为探讨MSC能否分化为角膜上皮细胞,将分离培养的灵长类动物恒河猴P3代MSC在体外基质微环境中通过3种方案诱导,对诱导前后的MSC用形态学观察、免疫组织化学技术和流式细胞仪检测评价其分化情况.结果显示,Ⅲ组MSC表现出角膜上皮前体细胞的形态特征,检测出角膜上皮前体细胞的标志,包括integrinβ1,Cx43,Pax6和P63的表达.这说明,在适宜条件下,MSC能够诱导分化为角膜上皮前体样细胞,有可能作为构建生物角膜的种子细胞来源,进行眼表修复.

山羊角膜缘干细胞荧光蛋白(Venus)细胞株的建立及角膜上皮植片构建

角膜缘干细胞是角膜上皮更新与修复的来源,角膜上皮受损严重常会导致角膜盲。尽管近几年通过角膜缘干细胞移植术(LSCT)治愈角膜上皮受损的临床应用已被推广,但是对于角膜缘干细胞移植受损机体后的修复机理并不明确。为了实现角膜缘干细胞移植后的活体追踪,使用G418筛选标记有Venus荧光蛋白的角膜缘干细胞株(GLSC-V),并以其为种子细胞接种于去上皮羊膜上,体外培养21d构建成荧光角膜上皮植片。荧光倒置显微镜下观察GLSC-V的细胞质和细胞核均有绿色荧光表达,在体外培养荧光至少持续3个月。免疫荧光检测GLSC-V细胞P63、Integrinβ1均呈阳性表达,对GLSC-V细胞及未转染的GLSCs进行半定量RT-PCR检测显示,两组细胞皆未表达终末分化角膜上皮细胞基因k3、k12,GLSC-V中p63及pcna较未转染组细胞略上调,venus强表达。经HE染色观察构建的人工角膜组织由5～6层上皮细胞组成,组织中上表皮细胞个数少、体积大且呈扁平状;基底部细胞密集、体积小且成立方状。经免疫荧光检测仅组织基底部最基层细胞表达P63,上表皮细胞不表达。该人工角膜与正常角膜上皮组织结构特性相似,可用于移植,为研究角膜缘干细胞修复严重受损角膜上皮机理奠定基础。

人羊膜缓释支架联合神经干细胞治疗脊髓损伤

目的探讨去上皮细胞羊膜（DMAM）构建药物缓释组织工程支架联合神经干细胞（NSCs）在大鼠脊髓全横断损伤模型中的治疗效果。方法取出生24h内的SD大鼠8只，剥离双侧海马分离、培养、纯化、鉴定NSCs备用。获取健康产妇羊膜，制备成DHAM。裁取两块DHAM4cm×4cm大小，吸取含5×10^9／LNSCs的细胞悬液分别种植其上。一块用2．5ml纤维蛋白黏合剂与18μg鼠神经生长因子的混合剂喷洒于其无细胞面，另一块单纯用18μg鼠神经生长因子喷洒于其无细胞面，卷成圆柱形支架后，分别制成DHAM药物缓释组织工程支架和无缓释功能的DHAM药物组织工程支架。将36只实验大鼠制作脊髓完全横断损伤模型，随机分为3组。A组为DHAM药物缓释组织工程支架移植组；B组为无缓释功能的DHAM药物组织工程支架移植组；C组为旷置缺损组。术后分别在1、2、4、8周对各组运动功能用脊髓损伤后后肢运动功能（BBB）评分系统进行评价。在第8周处死各组大鼠取材，行苏木素-伊红（HE）染色和镀银染色以及免疫组织化学染色观察形态学结果。结果术后8周，A组BBB评分达（11．63±0．58）分，明显高于其余两组（P〈0．05）。苏木素-伊红（HE）染色见A组大部分DHAM支架呈规则平行排列，DHAM支架内可见较多细胞存活生长。部分细胞发出丝状纤维沿DHAM支架间隙生长。B组DHAM支架不能保持平行排列的状态，呈波浪状或网状，细胞发出的丝状纤维混乱生长，缺乏方向。C组脊髓断端可见空洞形成。新长出的轴突杂乱交织在一起。神经元核抗原（Neun）抗体免疫组织化学染色显示部分存活的神经干细胞分化为神经元。镀银染色和神经丝蛋白-200（NF-200）抗体免疫组织化学染色证实支架内存活的细胞发出的丝状纤维为神经轴突。结论DHAM药物缓释支架联合NSCs组建的组织工程支架对大鼠脊髓缺损有良好的治疗潜力。

新型联合基质桥接大鼠脊髓横断性损伤断端促进运动功能恢复实验研究

目的研究新型联合基质——BMSCs-去上皮细胞羊膜(denuded human amniotic membrane,DHAM)桥接大鼠脊髓横断性损伤断端,促进轴突再生及提高后肢运动功能的作用。方法取健康产妇正常剖宫产术后自愿捐献的羊膜,经联合消化法彻底去除表面上皮细胞制备DHAM,并行HE染色观察。健康4周龄雌性Wistar大鼠4只,取骨髓行BMSCs分离、培养,取第4代细胞以PKH26标记后,以1×105个/cm2密度接种于DHAM上制备联合基质(BMSCs-DHAM)。倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察BMSCs生长状态。另取8周龄雌性Wistar大鼠40只,体重200～220g,制备T9脊髓横断性损伤模型,随机分为4组,每组10只。A、C组分别用BMSCs-DHAM和单纯DHAM包裹脊髓的2个断端,B、D组分别于脊髓损伤中心注射10μL细胞浓度为1×104个/μL的BMSCs和等量生理盐水。术后12周采用BBB运动评分检测大鼠后肢运动功能恢复情况,行皮层运动诱发电位(motion evoked potential,MEP)测定;生物素化葡聚糖胺(biopinylated dext anamine,BDA)顺行示踪检测及神经丝蛋白200(neurofilament protein200,NF-200)免疫荧光染色观察。结果HE染色显示联合消化法成功制备DHAM。镜下观察到BMSCs在DHAM上生长状态良好。术后12周,A组BBB评分达(12.50±1.26)分,明显高于其余各组(P<0.05)。MEP测定显示,A组潜伏期(3.52±2.45)ms及波幅(480.68±18.41)μV,恢复效果优于其余各组(P<0.05)。BDA顺行示踪观察示,A组损伤平面以下BDA通过损伤部位的轴突再生率为54.12%±3.30%,均高于其余各组(P<0.05);且A组NF-200免疫荧光染色亦可见大量再生轴突通过损伤部位。结论新型联合基质BMSCs-DHAM一定程度上提高了脊髓横断性损伤大鼠的后肢运动功能,是一种具有广泛应用前景的基质材料。