脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶基因cefEF的克隆及序列分析

利用氯化苄分别从真菌顶头孢 (Cephalosporiumacremonium)和产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)中提取总DNA ,通过PCR方法扩增脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶 羟化酶基因cefEF ,结果只能从产黄头孢DNA中扩增出cefEF基因。测序结果表明 ,其与已报道的基因序列只有 3个碱基的差异 ,推断的氨基酸序列只有 2个氨基酸有差异 ,并未涉及活性中心。同时表明 ,国外所指的与该酶有关的顶头孢 (Cephalosporiumacremonium或Acremoniumchryso genum)对应的是国内的产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)。

提升头孢菌素C发酵效率的复合碳源补料工艺开发及代谢机制

开发了一种以葡萄糖和豆油为底物碳源的复合补料策略,能够显著提升头孢菌素C(CPC)的合成效率,使其产量提升了14.8%,并观测到碳源变化在宏观呼吸代谢、中间代谢物、细胞内通量分配和还原力NADPH利用方面产生了全局影响,其中二氧化碳释放速率(CER)的变化表明在葡萄糖和豆油复合补料策略下细胞中心代谢网络的通量发生了明显改变,碳流向CPC的通量得到增强,同时促进了蛋氨酸和丝氨酸的胞外吸收。胞内有机酸α-酮戊二酸、丙酮酸、苹果酸的浓度明显提升,有利于谷氨酸、缬氨酸和半胱氨酸等核心氨基酸的合成,从而有利于CPC生产。主成分分析(PCA)的载荷测定结果表明大多数氨基酸和CPC合成呈正相关,谷氨酸的胞内含量与CPC合成的关联性最强,而α-氨基己二酸和赖氨酸积累反而不利于CPC合成。细胞还原力方面,豆油和葡萄糖组合工艺有助于NADPH更多地用于CPC合成,使得CPC快速合成时对NADPH的大量需求得到了满足。这些结果表明改变底物能够对细胞内部的代谢产生全方位的影响,复合补料策略在优化CPC合成中具有巨大潜力。

顶头孢霉菌产头孢菌素C发酵培养基优化

以头孢菌素C生产菌株顶头孢霉菌为研究对象,研究了多种氮源对头孢菌素C产量的影响。通过多因子二水平分析实验、爬坡实验和响应面法优化发酵培养基,确定最佳氮源为蛋氨酸、玉米蛋白粉、豆油,最佳发酵培养基配方:蛋氨酸为0.93 g/L、玉米蛋白粉为4.96 g/L、豆油为6.33 g/L。在此发酵配方下,头孢菌素C产量可达33.21 g/L,较初始配方提高16.24%。

豆油对头孢菌素C发酵影响的初步研究

本文主要考察了基础培养基添加豆油以及不同发酵时间流加豆油对头孢菌素C发酵特性的影响。实验结果表明在72h,84h,96h三个时间添加点中,以72h添加豆油为最佳;72h的豆油添加中以0.8%的添加量效果最好,其脂肪酶活比对照平均高出14.8%,放瓶效价提高6.6%。为以后进行的发酵罐实验提供了有参考价值的数据。

头孢菌素C发酵液陶瓷膜过滤过程中的影响因素研究

为考察陶瓷膜在头孢菌素C发酵液膜过滤过程中的应用性能进行了实验研究,对影响较为显著的因素进行了分析讨论。给出了渗透通量在膜过滤过程中变化的完整曲线,分别分析说明了平均压差、顶洗、膜面流速等操作条件与渗透通量的关系。分析了不同温度下的CPC收率理论值与实测值的关系,并在此基础上考察了温度对渗透通量的影响。根据浓差极化理论,给出了渗透通量与浓缩比的关系式,并对其进行了实验验证。结果表明,较高的温度(15℃)有利于头孢菌素C发酵液膜过滤过程的进行,渗透通量与浓缩比a的对数呈线性关系,通量主要受到保留液主体固形物浓度CB的影响。此外,实验还发现,通过"清水置换-碱洗-清水置换-酸洗-清水置换"联合清洗方法,可使膜通量恢复到新膜通量的90%以上。

头孢菌素C高产菌株的推理选育

目的优化推理选育条件,获得头孢菌素C高产菌株。方法根据头孢菌素C的生物合成途径和代谢调控机制设计菌种推理选育方案,原始出发菌株经紫外诱变后,采用托盘琼脂柱筛选法依次对铜离子、丙二酸及头孢菌素C耐受菌株进行选育。结果最终获得一株头孢菌素C高产菌株TBC-68071,其产量较原始菌株提高了154.6%,且高产特性稳定。结论对铜离子、丙二酸及头孢菌素C耐受的顶头孢霉菌株可以高产头孢菌素C,推理选育克服了随机筛选的盲目性,提高了菌种筛选的效率。

头孢菌素C发酵液流变特性的研究

通过测定头孢菌素C发酵液的粘度,研究非牛顿体系的流变特性,根据体系的凯松流体模型确定本构方程。

头孢菌素C发酵液膜过滤过程中收率的估算与控制

通过对头孢菌素C发酵液膜过滤过程的分析,引入了前浓缩比a、洗滤阶段稀释比b和后浓缩比c3个参数.针对采用连续洗滤操作模式和间歇洗滤操作模式的膜过滤过程,分别给出了总收率计算式和采用分段函数表示的过程收率计算式.通过计算比较了CFD和IFD操作模式下收率的变化情况,并进行了实验验证.结果表明,恰当选择的操作模式和参数值将有助于提高过程收率和缩短过滤时间,计算式能够为有效控制过滤过程收率提供理论依据.

菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系

利用显微图像分析法对顶头孢霉菌的菌丝形态进行了定量研究,并统计分析了头孢菌素C发酵过程中的菌丝形态的变化规律,具体对菌丝长度、菌丝宽度和菌丝生长单位进行了定量分析,分析了菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系。研究表明头孢菌素C的合成是在细长菌丝分化成膨大菌丝片段后才启动的,头孢菌素C可能主要是在膨大菌丝分化成节孢子的过程中被合成。

头孢菌素C酰基转移酶在顶头孢霉中的表达

以假单胞菌的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶为基础,根据顶头孢霉密码子偏爱性及RNΑ二级结构预测分析,设计并合成了全长2349bp的CPC酰基转移酶基因ecs,并将其在大肠杆菌中表达。结果证明,表达蛋白能将CPC转化为7-ΑCΑ。将ecs表达质粒转化CPC产生菌顶头孢霉,通过PCR、Southern blotting以及Western blotting等方法验证,表明ecs基因已成功整合到顶头孢霉染色体上并得到表达,重组菌的发酵也显示部分CPC直接转化成了7-ΑCΑ。

硅藻土助滤剂在头孢菌素C发酵液过滤中的应用研究

研究了硅藻土助滤剂在头孢菌素C发酵液过滤中的应用,并比较了粗、中、细3种不同粒度的硅藻土助滤剂使用中的不同性能指标,目的在于选择适宜的硅藻土助滤剂应用于生产,增加头孢菌素C收率,降低生产成本。实验结果表明:使用硅藻土助滤剂可以解决头孢菌素C发酵液直接过滤滤速慢、澄清度差、收率低的问题。通过实验比较,3种粒度的硅藻土助滤剂的滤过收率无明显差别,而粗、中粒度助滤剂的滤速较快,细粒度的助滤剂的滤液透光率较好。因此推断,中、细粒度助滤剂搭配使用应能在保证滤速的前提下提高透光率,满足生产要求。

搅拌对顶头孢霉丝形态和头孢菌素C生物合成的影响

搅拌能充分混合物料,增强氧的传递,但搅拌强度过强会影响工业生产菌的菌丝形态和产物生成。在头孢菌素C的发酵生产过程中,菌丝形态与产素的关系密切,通过采用显微图像定量分析技术,计算菌丝总长度和菌丝平均生长单位,表明过高的搅拌速度会打断菌丝,造成机械损伤,明显降低产率。更换80m3生产罐搅拌桨之后,降低了剪切作用,大罐的发酵效价提高了33.3%,达到22926.8μg/m l。

头孢菌素C过滤过程中总过滤时间的优化与控制

针对头孢菌素C(CPC)发酵液在工业生产中难过滤的问题,在收率衡算模型基础上,结合浓差极化机理引入时间参数,针对连续洗滤过程(CFD)建立考虑时间的膜分离过程估算式,并以最短膜处理时间tmin为目标进行了优化求解。结果表明,在优化的膜处理过程中,CPC收率从85%增长到95%所用时间占总处理时间的30%～40%;而前浓缩比a值在0.5～0.8范围内时,总膜过滤时间差别不大。在一个相对较宽的可操作范围内,适当调整前浓缩比或/和调整目标收率,可以对生产过程的时效性及CPC收率、滤液/保留液体积等生产指标进行优化与控制。

利用神经网络预测头孢菌素C的生物合成

利用头孢菌素C发酵过程积累的数据,建立BP神经网络预估模型,实现以发酵前期的菌浓和pH对效价的预测,将此模型应用于生产实际,分别通过倒种和改变培养基中碳源组成的方法,使头孢菌素C的合成水平分别提高了11.8%和15.7%,表明模型具有较好的预测功能。

基于参数相关分析的头孢菌素C发酵过程溶氧调控策略

运用多参数检测的生物反应器及其相关计算机软、硬件技术,对头孢菌素C发酵过程中表征细胞代谢的宏观代谢特征参数进行了检测与相关性分析,表明发酵前期菌体形态分化有利于增加溶氧,膨大、断裂菌丝的形成能够启动头孢菌素C合成;发酵中期添加豆油为菌体提供碳源、同时兼作消泡剂,发酵后期添加豆油仅起消泡剂作用。在以上分析的基础上从过程理论上提出了头孢菌素C发酵中溶氧控制的策略。

超声辅助提取-固相萃取土壤中头孢菌素C的高效液相色谱法定量检测

建立了一种采用超声辅助提取(UAE)、强阴离子交换固相萃取(SAX-SPE)净化、高效液相色谱(HPLC)测定土壤中残留头孢菌素C(CPC)简单、快速方法。样品以超纯水为提取剂,超声辅助提取,SPE柱子以3 m L甲醇和3 m L水活化,采用5 m L的10%甲醇水溶液作为淋洗液,2 m L的5%甲酸水溶液/甲醇溶液(体积比50∶50)进行洗脱,高效液相色谱紫外检测器(HPLC-PDA)测定,检测波长λ=254 nm,柱温30℃,流动相为0.1%甲酸水溶液/甲醇溶液(体积比95∶5)对土壤中不同加标浓度的CPC进行检测,方法的回收率在77.9%~98.9%,标准偏差范围为5.0%~6.3%(n=5),方法检出限(LOD)为340.4μg/kg,定量限(LOQ)为1126.8μg/kg。同时采用此方法检测分析新疆某药厂附近阳性土壤样品,不同批次土壤样品结果分别为:检出(低于定量限)、1532.1μg/kg。

超滤法提纯头孢菌素C的应用研究

目的 研究既能提高滤液质量和过滤收率 ,又能简化操作工艺流程的提纯头孢菌素 C发酵液的方法 ,并对超滤过程中顶洗加水量进行探讨。 方法 采用 Ultra- flo超滤系统提纯未经任何预处理的头孢菌素 C发酵液。 结果 滤液中蛋白质含量仅为原工艺的 1/ 10 ,过滤收率由原工艺的 78%提高到 83.8%。系统平均膜通量可达 6 6 .3 L MH,且可长时间连续平稳运行 ,被污染的膜经清洗后与新膜没有明显的差异。理论加水量倍数为投料液的 1.8倍 ,实际的平均加水量倍数为 1.70倍。 结论 U ltra- flo超滤系统完全能代替原工艺提纯不经预处理的头孢菌素 C发酵液 。

头孢菌素C发酵过程代谢特性

考察了头孢菌素C的发酵过程特征，对发酵过程的重要生理参数DO、CER、OUR、RQ等进行了在线检测和相关分析，并分析了比生长速率和比产物生成速率的变化规律。在发酵过程中0UR、CER最高分别达到了90．2 mol／（m^3·h）和69．8 mol／（m^3·h），表明头孢菌素C发酵代谢强度很大，对氧的需求量也非常大。比产物生成速率在发酵60～100h最高达到2．15U／（h·g）（细胞干重）。同时分析了头孢菌素C发酵过程中甲硫氨酸代谢规律，表明维持培养基中一定浓度的甲硫氨酸对头孢菌素C的合成有促进作用。通过对三级发酵和四级发酵的比较，表明在现有的设备和工艺条件下，三级发酵生产头孢菌素C要优于四级发酵，同时通过控制发酵前期菌丝浓度可获得最大产素水平。

溶媒法或喷雾干燥法制备头孢菌素C钠盐

目的 比较溶媒结晶法和喷雾干燥法两种制备头孢菌素 C钠盐的方法。方法 头孢菌素 C发酵液经提取纯化制成钠盐浓缩液于无水乙醇中结晶或喷雾干燥法制备头孢菌素 C钠盐。结果 溶媒结晶法制备的头孢菌素 C钠盐含量和透光率均值分别为 84 .0 3%和 98.90 % ,喷雾干燥法分别为 75 .4 9%和85 .90 % ,两方法相比 P<0 .0 5。溶媒结晶法合格率为 10 0 % ,而喷雾干燥法合格率仅为 2 0 %。结论 溶媒结晶法制备头孢菌素 C钠盐的质量优于喷雾干燥法。