工业色谱法分离制备7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

基于工业色谱法分离制备抗癌药物紫杉醇的半合成前体10-去乙酰紫杉醇(10-DAP)。7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇(10-DAXP)在我国特有红豆杉品系(中华红豆杉)枝叶中含量丰富,以其为原料可制备紫杉醇最理想的半合成前体——10-DAP。本研究以部分纯化后的7-木糖基-10-去乙酰紫杉烷为原料,通过β-木糖苷酶水解该粗提物中的主要成分10-DAXP及其两个微量类似物7-木糖基-10-去乙酰三尖杉宁碱(10-DAXC)和7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇C(10-DAXP C),脱去其C-7位上的木糖基,水解产物采用大孔吸附树脂吸附,正相快速柱分离和反相制备色谱分离,可获得高纯度的目标物10-DAP,产物纯度为96%,整个工艺的收率大于75%。该方法适合以10-DAXP为原料大规模制备紫杉醇的半合成前体化合物10-DAP,为工业化生产紫杉醇开辟了一条新途径。

大孔吸附树脂提取7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

本研究利用大孔树脂富集7-木糖10-去乙酰紫杉醇的酶解产物10-去乙酰紫杉醇。首先以10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)绝对含量为指标,通过HPLC测定比较HP20、XAD4、XAD16、XAD1600四种大孔树脂对10-去乙酰紫杉醇的吸附与解吸性能力,筛选出最佳树脂XAD1600进行实验。最佳的吸附解吸条件为:树脂柱高径比10∶1,吸附流速20mL/min,吸附量23.85mg/mL,以6倍柱床体积的90%乙醇为洗脱液,洗脱流速20mL/min。经XAD1600型树脂富集后10-去乙酰紫杉醇回收率达96.5%,含量20.5%。且树脂柱重复使用3次后,其吸附能力仅降低5%。

紫杉醇化学半合成进展

综述了以 1 0 -去乙酰巴卡亭Ⅲ和 1 0

利用天蓝色链霉菌转化7-木糖紫杉烷的研究

紫杉醇是目前临床治疗癌症的一线化疗药物,资源紧张,价格昂贵。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)在红豆杉中含量可达紫杉醇的10倍,脱除木糖基后生成的10-脱乙酰紫杉醇(10-DAT)经乙酰化可生成紫杉醇。通过木聚糖平板对不同菌株进行筛选,从52株供试微生物中,发现27株在木聚糖平板上生长良好。经转化实验筛选,发现一株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor YUCM 410115)具有转化7-XDT为10-脱乙酰紫杉醇的能力。菌体细胞经破碎离心后,沉淀及上清液均无转化反应出现,而发酵液的硫酸铵沉淀物则可以转化7-XDT生成10-DAT,表明该菌株能产生一种胞外紫杉醇-7-木糖苷酶,发酵液酶活为6 268U。首次发现天蓝色链霉菌能够产生紫杉醇-7-木糖苷酶,为7-XDT转化生产紫杉醇提供了新的酶源。

美洲大蠊肠道产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的筛选及鉴定

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株。在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率。结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶。高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis。WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52%。美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9(GenBank Accession:MZ411692)具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础。

基于指纹图谱和网络药理学对曼地亚红豆杉质量标志物的分析研究

目的:基于指纹图谱和网络药理学方法,对曼地亚红豆杉质量标志物(Q-Marker)进行预测,建立基于Q-Marker的曼地亚红豆杉药材评价方法。方法:采用Waters SymmmetryShield^(TM)RP 18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸水为流动相,梯度洗脱,流速1 mL·min^(-1),柱温30℃,检测波长254 nm,进样体积10μL,建立8个年限24批曼地亚红豆杉药材指纹图谱并标定共有峰,采用层次聚类分析(hierarchical clustering analysis,HCA)进行分类评价,借助正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)筛选不同年限曼地亚红豆杉的主要差异性标志物;结合网络药理学,通过相应数据库筛选差异性标志物的核心靶点和关键通路,构建“成分-靶点-通路”网络图,以此预测曼地亚红豆杉的Q-Marker;采用HCA及主成分分析(principal component analysis,PCA)进一步验证曼地亚红豆杉的Q-Marker,综合评价其质量。结果:建立了24批曼地亚红豆杉药材指纹图谱,标定了25个共有峰,指认出18个化合物,包括紫杉烷类、黄酮类、生物碱类、甾体类、酚类,相似度均>0.900;HCA的结果显示不同年限曼地亚红豆杉存在一定的差异性;经OPLS-DA筛选出11个差异性标志物,分别为紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)、阿魏酸、山柰素、芦丁、金松双黄酮、穗花杉双黄酮、对羟基苯甲醛;基于差异性标志物,运用网络药理学从有效性角度对其进行分析,初步预测紫杉醇、10-DAB、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-DAT为曼地亚红豆杉的Q-Marker,主要通过作用于PIK3R1、AKT1、EGFR、HRAS、MAPK1等14个核心靶点,调控癌症通路、AGE-RAGE信号在糖尿病并发症中的作用等信号通路,发挥消肿散结、通经利尿的功效;HCA结果验证了预测的Q-Marker的合理性,PCA综合评价结果表明十年生春季采收的曼地亚红豆杉质量较佳。结论:基于指纹图谱和网络药理学方法筛选出紫杉醇、10-DAB、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-DAT为曼地亚红豆杉的Q-Marker,结合化学识别模式方法对不同年限曼地亚红豆杉的质量进行综合排序,其中十年生春季采收的得分最高,质量较好,为曼地亚红豆杉的质量标准的研究及资源评价提供了新思路。

基于中药整体性的红豆杉抗乳腺癌活性成分筛选方法研究

目的基于中药整体性建立2种红豆杉抗乳腺癌活性成分筛选方法:中空纤维细胞捕获结合高效液相色谱法(HFCF-HPLC)、细胞捕获-分散液相微萃取结合高效液相色谱法(CF-DLLME-HPLC)。方法 HFCF-HPLC是在模拟人体内环境状态下,将人乳腺癌MCF-7细胞种植到聚丙烯中空纤维管腔内部,再将该中空纤维放入红豆杉提取液中,筛选和捕获可以与细胞结合的抗乳腺癌活性成分群;CF-DLLME-HPLC是将MCF-7细胞与红豆杉提取液在细胞正常代谢的基础上共孵育,取不同孵育时间上清液进行分散液相微萃取处理,然后进行不同时间段下色谱分析比对,根据色谱峰变化发现潜在抗乳腺癌活性成分群。结果 HFCF-HPLC筛选出的活性成分是脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、云南紫杉烷;CF-DLLME-HPLC筛选出的活性成分是脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、金松双黄酮。结论 2种方法均可以筛选出有效的抗肿瘤活性成分群,为活性成分的筛选、中药质量的综合评价提供一种方便、普适和高效的新方法。