去亚甲基小檗碱抑制破骨分化减轻钛颗粒诱导的骨溶解

目的探讨去亚甲基小檗碱(demethyleneberberine,DMB)对破骨细胞和骨溶解的抑制作用。方法将20只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、钛(Ti)颗粒组、低剂量组(1mg/kg DMB)和高剂量组(10mg/kg DMB),2周后收集标本行显微计算机断层扫描和组织学分析;CCK-8法检测不同浓度DMB对小鼠骨髓巨噬细胞的毒性;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测成熟破骨细胞形成;实时荧光定量聚合酶法检测各组破骨细胞分化基因的表达情况。结果动物实验表明,与钛颗粒组比较,DMB能够明显抑制钛颗粒诱导的骨溶解,减轻骨破坏;细胞实验表明DMB在无明显细胞毒性的浓度下能抑制破骨细胞的形成和破骨细胞分化相关基因的表达。结论去亚甲基小檗碱可以通过浓度依赖的方式抑制破骨细胞的分化与成熟,有望成为治疗磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解的潜在药物。

盐酸去亚甲基小檗碱含量测定的HPLC分析方法建立及应用

该研究建立了盐酸去亚甲基小檗碱含量测定的HPLC分析方法。采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm,5μm）色谱柱,以50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（磷酸调节p H值至3.0）为流动相A,乙腈为流动相B,进行梯度洗脱,体积流量1 m L/min;检测波长349 nm;柱温30℃。结果表明,盐酸去亚甲基小檗碱供试品溶液在2-200μg/m L范围内浓度和峰面积成良好的线性关系,相关系数R为0.999 6,日内和日间精密度的RSD（%）均小于2%;平均回收率为101.6%,RSD（%）为1.0%。重复性和稳定性的RSD（%）分别为1.2%和0.8%。3批盐酸去亚甲基小檗碱原料药中盐酸去亚甲基小檗碱含量为97.8%,98.4%,98.2%。HPLC法测定盐酸去亚甲基小檗碱的含量具有较好的专属性和灵敏度,准确度高,且操作简便,重复性好。该方法可用于盐酸去亚甲基小檗碱的含量分析和质量控制。

小檗碱及其体内代谢产物对高糖诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤的保护作用

目的 探究小檗碱及其体内代谢产物对高糖诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤的保护作用。方法 将H9c2心肌细胞分成对照组、模型组、正常给药组、模型给药组,对照组用无血清DMEM培养,正常给药组于无血清DMEM中加药,模型组用含50 mmol·L^(-1)葡萄糖的无血清DMEM培养(造模剂量筛选实验设置25、50、100、200 mmol·L^(-1)),模型给药组于高糖无血清DMEM中加药,加药浓度分别为小檗碱1.25、2.50、5.00、10.00μmol·L^(-1),二氢小檗碱(DHB) 0.5、1.0、2.0、4.0μmol·L^(-1),小檗红碱1.25、2.50、5.00、10.00μmol·L^(-1),非洲防己碱(COL)1.25、2.50、5.00、10.00μmol·L^(-1),巴马汀3.125、6.250、12.500、25.000μmol·L^(-1),药根碱6.25、12.50、25.00、50.00μmol·L^(-1),去亚甲基小檗碱(DEM)6.25、12.50、25.00、50.00μmol·L^(-1),处理48 h后,通过细胞增殖计数(CCK-8)法检测细胞存活率;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测经典代谢调控通路沉默调节蛋白1(Sirt1)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α(PGC1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)基因水平,葡萄糖代谢相关基因丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)、葡萄糖激酶(GCK)、己糖激酶(HK2)、葡萄糖转运蛋白4(Glut4)表达水平,线粒体动力学相关基因线粒体融合蛋白2 (Mfn2)、视神经萎缩蛋白1 (OPA1)、动力学相关蛋白1(Drp1)水平及细胞凋亡相关基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、 B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)水平;通过Westernblotting实验检测PGC1α、 Glut4、线粒体氧化磷酸化系统(OXPHOS)蛋白表达。结果 与高糖模型组相比,小檗碱2.5、5.0、10.0μmol·L^(-1),DHB 1、2μmol·L^(-1),COL 5、10μmol·L^(-1),巴马汀12.5μmol·L^(-1),药根碱25、50μmol·L^(-1),DEM 12.5、25.0μmol·L^(-1)处理48 h的细胞存活率均显著上升(P<0.05、0.01、0.001);小檗碱、DHB、药根碱、DEM处理的心肌细胞中PDK4水平显著增加(P<0.05、0.001),小檗碱、DHB、DEM处理的心肌细胞中GCK水平显著增加(P<0.01、0.001),小檗碱、DHB、COL、巴马汀、DEM处理的心肌细胞中HK2水平显著增加(P<0.05、0.01),DEM处理的心肌细胞中Glut4水平显著增加(P <0.001);药根碱、DEM处理的心肌细胞中OPA1水平显著增加(P<0.05、0.001),小檗碱、DHB、COL、巴马汀、药根碱、DEM处理的心肌细胞中Drp1水平显著降低(P<0.01、0.001),小檗碱、DHB、药根碱、DEM处理的心肌细胞中Mfn2水平显著增加(P<0.05、0.001);小檗碱、DHB、COL处理的心肌细胞中Caspase-3水平显著降低(P<0.01、0.001),小檗碱、小檗红碱、COL、巴马汀处理的心肌细胞中Caspase-9水平显著降低(P<0.01、0.001),小檗碱、DHB、小檗红碱、COL、巴马汀、药根碱、DEM处理的心肌细胞中Bax水平显著降低(P<0.05、0.001),小檗碱、DHB、巴马汀处理的心肌细胞中Bcl-2水平显著增加(P<0.01、0.001);小檗碱及其代谢产物处理的心肌细胞中PGC1α、Glut4、OXPHOS表达均明显增加。结论 小檗碱体内代谢产物可以缓解高糖造成的H9c2心肌细胞损伤,其作用机制与调控Sirt1/PGC1α/PPARα信号通路,促进H9c2心肌细胞葡萄糖代谢、改善线粒体功能、抑制细胞凋亡有关。

小檗碱的酶反应动力学及其代谢酶表型和代谢产物研究

目的采用混合人肝微粒体和重组人源细胞色素酶P450(CYP)同工酶,研究小檗碱的代谢特性,明确参与小檗碱代谢的CYP酶亚型及其贡献度,并确证相关代谢产物的结构。方法将混合人肝微粒体分别与20、100、200、400、600、800、1 200 ng/mL的小檗碱共同孵育后,计算小檗碱酶反应动力学米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)、体外肝微粒体对药物的固有清除率(CLint);采用CYP酶的特异性抑制剂研究小檗碱的代谢表型;将重组人源CYP同工酶CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9与一定质量浓度的小檗碱孵育,UPLC法测定孵育液中原形药物的剩余量和代谢产物的生成量;整体归一化法计算各酶的代谢贡献度;LC-MS/MS法鉴定相关代谢产物。结果小檗碱在混合人肝微粒体中的Vmax为1.51nmol·mg-1·h-1;Km为2.69 nmol/mL;CLint为0.56 mL·mg-1·h-1。CYP2D6的特异性抑制剂奎尼丁和CYP1A2的特异性抑制剂呋喃茶碱对小檗碱的代谢有显著抑制作用,其他CYP酶抑制剂对小檗碱的代谢无显著影响。CYP2D6、CYP1A2对小檗碱代谢产物M1(去亚甲基小檗碱)的贡献度分别为75.253 9%、23.323 6%;对M2产物(唐松草分定或小檗红碱)的贡献度分别为46.893 8%、8.679 5%。小檗碱在体外混合人肝微粒体温孵体系中的主要代谢途径为O-去甲基化,可生成去亚甲基小檗碱和唐松草分定或小檗红碱。结论小檗碱在肝脏中主要被CYP2D6和CYP1A2代谢,分别生成去亚甲基小檗碱、唐松草分定或小檗红碱。