杜仲-续断药对通过调控铁死亡途径对去卵巢骨质疏松症大鼠的保护作用及机制研究

目的观察杜仲-续断药对对去卵巢骨质疏松症大鼠骨的保护作用及机制研究。方法40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组、雌激素组,每组10只。假手术组仅切除卵巢旁部分脂肪组织,剩余大鼠均切除双侧卵巢建立去卵巢骨质疏松(Ovariectomized osteoporosis,OVX-OP)症模型。中药组0.52 g/kg灌胃,雌激素组采用炔雌醇10μg/kg灌胃,假手术组、模型组灌胃等量生理盐水。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清雌二醇(Serum estradiol,E2)、骨钙素(Osteocalcin,OC)含量;双能X射线动物骨密度分析仪检测大鼠股骨骨密度值;苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠骨组织形态;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测股骨组织尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1,NOX1)、上游信号抑癌基因(p53)、谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)和铁蛋白重链(Ferritin heavy chain1,FTH1)蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组股骨密度、E2水平、GPX4和FTH1蛋白水平显著降低(P<0.01),OC水平、NOX1、p53蛋白水平显著增加(P<0.01);与模型组相比,中药组和雌激素组股骨密度、E2水平、GPX4和FTH1蛋白水平显著升高(P<0.01),OC水平、NOX1、p53蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论杜仲-续断药对可增加去卵巢骨质疏松大鼠股骨骨密度、减轻骨质疏松,该作用可能与抑制股骨铁死亡有关。

去卵巢骨质疏松症大鼠模型骨密度的变化

观察3月龄SD雌鼠切除双侧卵巢29周内模型组和雌二醇组动物第三腰椎及股骨骨密度的变化,同时与假手术组比较。结果表明,SD雌性大鼠切除卵巢9周股骨骨密度明显低于假手术组(P<001),13周后腰椎骨骨密度也有显著差异(P<001),29周内模型稳定。皮下注射苯甲酸雌二醇40μgkg×2次周,在12周能够明显提高切卵巢SD大鼠的股骨骨密度并使其接近正常,16周后第三腰椎的骨密度也能够明显提高。切卵巢骨质疏松症大鼠模型治疗性给药需要大约9～13周左右模型才能成功,切除卵巢后29周内模型仍然稳定。

虎潜丸对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织的保护作用及其机制研究

目的:探讨虎潜丸对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织的保护作用,以及通过调控碱性磷酸酶(ALP)、白细胞介素-6(IL-6)和血清骨保护素(OPG)的表达而防治骨质疏松症的机制研究。方法:采用卵巢切除法复制绝经后骨质疏松症大鼠模型,随机分为模型组、虎潜丸组、雌二醇组,同时设置假手术组作为对照,各组分别给予相应的药物灌胃。灌胃12周后取血处死,称量各组大鼠的体质量、子宫重量;取大鼠左侧股骨、胫骨进行骨密度检测;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中血糖、血脂、钙磷的变化;ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、ALP、OPG的水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠骨密度显著下降(P<0.05),骨微结构破坏明显;与模型组比较,虎潜丸组大鼠骨密度增加,骨小梁的完整性升高,骨微结构得到改善,体质量增长明显下降,血脂血糖水平降低,IL-6、ALP含量均有所降低,OPG含量升高,血钙含量有明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:虎潜丸能够提高去卵巢大鼠的骨量,防治绝经后骨质疏松症,其作用机制可能与降低ALP、IL-6,提高OPG含量有关。

艾灸对去卵巢骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的观察艾灸三阴交、关元穴对去卵巢骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)中Wnt/β-catenin信号通路的影响,探索艾灸影响骨代谢的内在机制。方法将60只6月龄SD大鼠随机分为正常组(20只)和去卵巢组(40只),采用去卵巢法复制大鼠骨质疏松症模型,将去卵巢组再随机分为模型组、雌二醇组和艾灸组,每组10只。采用MTT法检测大鼠BMMSCs活性,酶联免疫吸附法检测大鼠BMMSCs中骨钙素(bone glaprotein,BGP)含量,实时荧光定量PCR法测定Wnt3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白-5(low density lipoprotein receptor associated protein-5,LRP-5)、LRP-6、Dkk1、β-连环蛋白(β-catenin)和T细胞因子(T-cell factor,TCF)mRNA相对表达水平,Western blot法测定Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白的表达水平。结果在体外培养第12、16天时,艾灸可显著提高骨质疏松症大鼠降低的BMMSCs活性。艾灸可显著升高骨质疏松症大鼠BMMSCs中降低的BGP含量,显著上调BMMSCs中降低的LRP-5、LRP-6 mRNA的表达水平,显著上调降低的Wnt3a、β-catenin和TCF mRNA及其蛋白的表达水平,显著下调升高的Dkk1 mRNA及其蛋白的表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论艾灸三阴交、关元穴增加去卵巢大鼠BMMSCs活性,提高BGP含量,其机制与干预Wnt/β-catenin信号通路有关。

自拟补肾活血颗粒对去卵巢骨质疏松症大鼠的治疗作用

目的:观察自拟补肾活血颗粒(MBHG)对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用。方法:雌性SD大鼠,随机取10只作为假手术组(sham组),其余大鼠制备去卵巢骨质疏松症,随机分为:模型(model)组;补肾活血颗粒高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)剂量组;阳性对照组(戊酸雌二醇组)。每组10只,连续灌胃给药12周。观察大鼠骨小梁形态,测量骨小梁的面积、厚度、间距及面积百分数,全自动分析仪检测血清中钙、磷和碱性磷酸酶(ALP)含量,测量大鼠骨密度(BMD),ELISA法检测血清雌激素(E2)、骨钙素(BGP)、骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子(RANK)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)水平。结果:与模型组比较,各给药组骨小梁显著变宽,数目增多,网状结构有部分恢复。各给药组骨小梁厚度、骨小梁面积和骨小梁面积百分数均大于模型组,骨小梁间距均小于模型组(P<0.05)。各给药组血清中钙、磷、E2、OPG以及股骨BMD水平均显著高于模型组,ALP、BGP、RANK和RANKL水平均显著低于模型组(P<0.01)。结论:自拟补肾活血颗粒对去卵巢大鼠骨质疏松症有显著的治疗作用。作用机制可能与上调OPG、抑制RANKL分泌有关。

芦丁对去卵巢骨质疏松症大鼠的防治作用

目的探讨芦丁在去卵巢骨质疏松大鼠中发挥的抗骨质疏松作用,找到治疗绝经后骨质疏松症的新思路。方法取40只大鼠,10只行剖腹手术未摘除卵巢为假手术组,30只行去卵巢手术。去卵巢手术大鼠随机分成3组:OVX组(用生理盐水灌胃)、R5低剂量组[喂食芦丁剂量5 mg (kg·d)]、R10高剂量组[喂食芦丁剂量10 mg (kg·d)],每日灌胃一次,观察3个月。观察芦丁干预前后大鼠体重和子宫指数的变化,利用双能X线骨密度仪测定大鼠右侧股骨的骨密度(bone mineral density, BMD)。经HE染色分析左侧胫骨组织形态学。用ELISA方法检测IL-6,IFN-γ、TNF-α的含量,观察芦丁对炎性指标的影响。同时监测干预后的去卵巢大鼠体内E2、1,25(OH)2D3_、OCN水平变化。结果芦丁对去卵巢大鼠体重无显著影响,但干预组子宫指数显著升高,且提高了去卵巢大鼠的BMD,降低了OVX大鼠的炎症因子IL-6、TNF-α、INF-γ水平。芦丁干预后E2和1,25(OH)2D3水平显著升高,并且通过剂量依赖性逆转了大鼠的血清OCN水平,使骨小梁变厚。此外,芦丁显著改善了去卵巢大鼠骨小梁的平均厚度及平均骨体积分数。结论芦丁具有明显抗骨质疏松的活性,是一种理想的治疗骨质疏松症的备选药物。

橙皮苷对去卵巢骨质疏松症大鼠骨质流失和机制的影响

目的研究橙皮苷对去卵巢骨质疏松大鼠骨质流失和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子kappa B配体的受体激活物(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)/RANK通路的影响。方法将48只雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组、去卵巢骨质疏松组、橙皮苷低剂量组、橙皮苷中剂量、橙皮苷高剂量组和雌激素组。检测骨组织骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp),通过HE染色观察骨组织病理损伤,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测人Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal peptide collagen typeⅠ,CTX-Ⅰ)和血清骨钙素(bone glaprotein,BGP)的表达量。运用qRT-PCR和Western bolt分别检测骨组织OPG、RANKL、RANK的mRNA和蛋白表达。结果在橙皮苷治疗后,与去卵巢骨质疏松组相比,骨质疏松标志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高,Tb.Sp水平降低;大鼠骨小梁数量明显增加,且骨小梁连接更为紧密;骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平降低;骨形成标志物BGP水平升高。OPG mRNA相对表达量和蛋白的表达量升高,RANKL和RANK mRNA相对表达量和蛋白的表达量降低。结论橙皮苷能缓解去卵巢骨质疏松大鼠骨质流失并调节OPG/RANKL/RANK信号通路。

鹿茸补骨片对去卵巢骨质疏松症大鼠骨密度及子宫湿重的影响

目的研究鹿茸补骨片对去卵巢骨质疏松症大鼠骨密度含量及子宫湿重影响。方法将大鼠设置分组,经口灌胃不同配伍的受试物,厂家推荐鹿茸补骨片成人每日摄入量为0.03g/kg·bw,以推荐剂量的5、10、30倍(0.15、0.30、0.90g/kg)给药,记录并观察鹿茸补骨片对大鼠体重、子宫湿重、股骨长度、股骨中心骨密度、股骨远心端骨密度、骨钙含量的影响。结果与阴性对照组比较,鹿茸补骨片能明显增加去卵巢骨质疏松症大鼠子宫湿重,并且能够增加骨钙含量及骨密度含量。结论鹿茸补骨片具有增强骨密度的作用。

基于去卵巢大鼠开展针灸治疗绝经后骨质疏松症的实验研究进展

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是随着年龄的增长女性绝经后,骨吸收超过骨形成,导致骨量减少、骨脆性升高、骨组织显微结构退化,临床表现为易发生骨折的一种代谢疾病[1-2]。以往研究表明PMOP主要是由于雌激素水平的下降导致[3-4],但近年来已有越来越多的研究发现PMOP的发病涉及骨免疫异常、慢性炎性反应、骨髓微循环障碍等多方面、多通道因素调控[5]。目前,在国内外治疗PMOP方面,药物治疗仍是最常用的方法。然而,长期持续使用这些药物往往会产生一定的毒副作用[6]。针灸作为一种高效的、无毒副作用的疗法已大量应用于临床治疗PMOP,且取得较佳疗效[7-9]。一项纳入16项研究涉及1585例PMOP患者在内的系统评价表明针灸治疗在改善PMOP骨痛、提高临床有效率等方面具有较好疗效[10],为针灸治疗PMOP提供临床证据。

跑台运动对切除卵巢大鼠骨质疏松症的保护机制

目的由Hedgehog-Gli信号通路探讨跑台运动对卵巢切除所致骨质疏松症大鼠的保护机制。方法50只雌性SD大鼠,随机分为假手术组(S,15)、造模组(Z,35)。假手术组仅切除卵巢周围的少量脂肪,造模组切除双侧卵巢。术后10周采用苏木精-伊红染色法验证造模。将成功造模的大鼠随机分为模型组(M)、戊酸雌二醇阳性对照组(P)和跑台运动组(E),每组各10只。P组以0.184 mg/(kg·d)的标准灌服戊酸雌二醇混悬液,其他组灌服等剂量生理盐水,每日一次,E组同时进行每周5 d,每次30 min的中等强度跑台训练,干预12周后取材,检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Ⅰ型前胶原N端肽(PINP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(CTX)和骨钙素(OC)的水平,Micro-CT检测骨密度,强度仪上检测骨力学性能,Western blot检测股骨中Shh、Ptc、Smo及Gli蛋白表达水平。结果与S组相比,M组骨形成代谢指标、骨密度值、骨力学性能和股骨Shh、Ptc、Smo及Gli蛋白表达均下降(P<0.01);与M组相比,P组和E组骨形成代谢指标、骨密度值、骨力学性能和股骨Shh、Ptc、Smo及Gli蛋白表达均上升(P<0.01);与P组相比,E组股骨Shh、Ptc、Smo及Gli蛋白表达升高(P<0.05)。结论12周跑台运动可通过上调股骨Shh、Ptc、Smo及Gli的表达介导对去卵巢大鼠骨代谢的调节,改善骨质疏松症。

杜仲汤对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响及机制研究

目的探讨杜仲汤对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响及机制。方法将42只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组(戊酸雌二醇,0.09 mg·kg^(-1))、谷胱甘肽组(36 mg·kg^(-1))以及杜仲汤低、中、高剂量组(0.54、1.08、2.16 g·kg^(-1))。去卵巢模型大鼠复制成功后,按照设定剂量灌胃给药,灌胃体积为10 mL·kg^(-1),每日1次,连续给药200 d。采用生化试剂盒检测大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量;ELISA法检测大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨保护素(OPG)含量;骨密度仪检测大鼠股骨骨密度;HE染色法观察大鼠胫骨组织病理变化;Western Blot法检测骨组织中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、OPG、一型胶原(COL1)蛋白表达水平;RT-PCR法检测骨组织中BMP-2、Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠体质量增长值显著升高(P<0.01);血清GSH、OPG的水平显著降低(P<0.05,P<0.01),TRACP水平显著升高(P<0.01);骨密度明显降低(P<0.05);骨小梁结构不完整,出现明显断裂,小梁数稀疏且明显变薄;骨组织中BMP-2、OPG、COL1蛋白表达水平均显著下降(P<0.01),BMP-2、RUNX2mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,杜仲汤低、中、高剂量组大鼠体质量增长值均显著降低(P<0.05,P<0.01),血清GSH水平显著升高(P<0.01),骨小梁结构明显改善,骨小梁变粗,数量增加,骨组织中BMP-2、RUNX2 mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);杜仲汤中剂量组大鼠的血清OPG水平显著升高(P<0.01);杜仲汤低剂量组大鼠的血清TRACP水平显著降低(P<0.01),骨组织中COL1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);杜仲汤低、中剂量组大鼠的骨密度显著升高(P<0.01),骨组织中OPG蛋白表达水平明显升高(P<0.01);杜仲汤中、高剂量组大鼠骨组织中BMP-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论杜仲汤能提高去卵巢大鼠的骨密度,保护骨小梁完整性,对去卵巢大鼠骨质疏松症有一定防治作用,其机制可能与提高血清GSH、OPG水平,降低TRACP水平,上调BMP-2、OPG、COL1蛋白以及BMP-2、RUNX2mRNA表达,从而促进骨形成有关。

酒花提取物调控Wnt/β-catenin信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠的作用及机制研究

目的探讨酒花提取物对去卵巢骨质疏松大鼠的作用及机制。方法将60只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(戊酸雌二醇,0.105 mg·kg^(-1))和酒花提取物低、中、高剂量组(65.625、131.120、196.875 mg·kg^(-1)),每组10只。除假手术组外,其余各组大鼠均切除双侧卵巢,术后灌胃给药,每日1次,连续给药90 d。采用HE染色法观察大鼠骨组织病理形态变化,测定骨形态计量学参数,计算骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨小梁面积百分数(Tb.Ar);测定大鼠骨组织生物力学指标:最大载荷、弹性模量、断裂强度;采用ELISA法测定大鼠血清雌激素(E_(2))、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)、骨钙素(OC)、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)含量;采用全自动生化仪测定大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)含量;采用RT-PCR及Western Blot法检测大鼠胫骨组织OPG、RANKL、ERα、ERβ、Wnt16、β-catenin mRNA及蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠胫骨骨小梁断裂,骨髓腔变大,呈现骨质疏松结构;胫骨Tb.N、Tb.Th、Tb.Ar明显降低(P<0.05),Tb.Sp明显升高(P<0.05);股骨的最大载荷、弹性模量和断裂强度均明显降低(P<0.05);血清E_(2)含量明显降低(P<0.05),TRACP5b、OC、ALP、BALP含量均明显升高(P<0.05);胫骨组织的OPG、OPG/RANKL、ERα、ERβ、β-catenin、Wnt16 mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.05),RANKL mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组相比,阳性对照组及酒花提取物高剂量组的上述指标均明显回调(P<0.05)。结论酒花提取物对绝经后骨质疏松症具有一定的防治作用,其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路,进而调控OPG/RANK/RANKL信号通路有关。

青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织PI3K/Akt信号通路的影响

目的 探讨青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法 采用随机数字表法将72只3月龄SPF级雌性SD大鼠分为假手术组、模型组和青娥方组,每组24只。大鼠均按40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉,于下腹部正中作切口,模型组和青娥方组均切除双侧卵巢,假手术组切除卵巢周围少量脂肪组织后立即关腹,缝合伤口。造模1周后,假手术组和模型组予2 mL0.9%氯化钠溶液灌胃,青娥方组按浸膏量0.42 g/(kg·d)予青娥方药液灌胃,每日1次,连续灌胃12周。3组分别于干预4、8、12周后各处死8只并取材。Masson染色法观察股骨颈形态;检测股骨骨密度和骨生物力学指标最大载荷;ELISA法检测血清PI3K、Akt含量;qPCR和Western blot检测腰椎PI3K、Akt和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)mRNA相对表达水平和蛋白表达量。结果 与假手术组比较,模型组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平明显升高(P<0.05);第12周股骨最大载荷明显降低(P<0.05);第8、12周股骨骨密度明显降低(P<0.05),腰椎PI3K mRNA相对表达水平均明显升高(P<0.05),PI3K蛋白表达量明显升高(P<0.05);第4、8、12周血清PI3K、Akt含量均明显升高(P<0.05),腰椎Akt、GSK3β蛋白表达量均明显升高(P<0.05),GSK3β mRNA相对表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,青娥方组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平和蛋白表达量明显降低(P<0.05);第12周股骨最大载荷明显升高(P<0.05),血清Akt含量均明显降低(P<0.05),腰椎Akt蛋白表达量明显降低(P<0.05);第8、12周股骨骨密度明显升高(P<0.05),腰椎PI3K、GSK3β mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),PI3K蛋白表达量明显降低(P<0.05);第4、8、12周血清PI3K含量明显降低(P<0.05)。结论青娥方可改善去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学性能,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

枸杞多糖对C57BL/6J骨质疏松症小鼠的早期防治

目的探讨枸杞多糖(LBP)对C57BL/6J骨质疏松症小鼠的早期防治作用。方法选用12周C57BL/6J雌鼠,采用双侧卵巢完全切除术制备骨质疏松症模型,假手术组切除卵巢周围脂肪组织,术后1周,选取手术成功的小鼠分为假手术组、模型组和LBP组。LBP组给予灌胃LBP 0.1 g·kg^(-1),1次/d,连续12周,假手术组和模型组灌胃等量蒸馏水。酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清中雌二醇(E_(2))含量;生物化学方法检测血清氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;Micro CT扫描胫骨微观结构,观察骨小梁厚度(Tb·Th)、骨表面积和骨体积之比(BS/BV)、骨小梁分离度(Tb·Sp)、骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨体积(BV)的变化。结果与假手术组小鼠比较,模型组小鼠的体质量增长率升高、子宫脏器系数明显减小、血清E_(2)含量下降、血清氧化应激指标MDA含量增高、SOD活力降低(P均<0.01);与模型组小鼠比较,LBP组小鼠子宫脏器系数、血清E_(2)含量差异均无统计学意义(P均>0.05),但体质量增长率下降、血清MDA含量降低、SOD活力增加(P均<0.01),骨组织BMD、BV升高(P均<0.05),Tb·Th及BV/TV均显著升高(P均<0.01)。胫骨三维重建图显示,模型组骨皮质变薄,呈现骨质疏松改变,骨小梁数量减少,排列紊乱,髓腔明显扩大;LBP组较模型组骨小梁数量增加。结论LBP可能通过调控早期骨质疏松症小鼠的氧化应激反应,发挥改善骨质疏松的作用。

淫羊藿、当归及其配伍用药对绝经后骨质疏松症大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的:探讨淫羊藿、当归及其配伍通过TGF-β1/Smads信号通路防治绝经后骨质疏松症的作用机制。方法:选取42只雌性未育SD大鼠随机分假手术组(7只)和联合造模组(35只),采用双侧卵巢摘除联合地塞米松肌内注射法建立病证结合的绝经后骨质疏松症模型;造模6周后,将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、淫羊藿组、当归组、配伍组、戊酸雌二醇组,每组6只,并给予相应药物治疗8周。治疗结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察股骨组织形态,ELISA法检测大鼠血清TGF-β1水平,免疫荧光法检测骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA和Smad7 mRNA表达。结果:模型组大鼠TGF-β1、Smad2/3表达水平均低于假手术组(P<0.01),Smad7的表达水平高于假手术组(P<0.01);干预治疗后,配伍用药能显著上调血清TGF-β1的表达水平(P<0.01);各给药组均能显著上调股骨组织中TGF-β1、Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达水平(P<0.01),下调股骨组织中Smad7蛋白及Smad7 mRNA表达水平(P<0.05),且与单独用药相比,配伍用药的效果更加明显(P<0.01)。结论:淫羊藿、当归及其配伍有改善骨代谢、修复骨显微结构的作用,其作用机制可能为通过调控TGF-β1/Smads信号通路,改善相关细胞因子的异常表达,从而发挥骨保护作用以防治骨质疏松症。

金水宝对去卵巢小鼠骨质疏松的保护作用及其机制

目的探讨金水宝对去卵巢小鼠骨质疏松的保护作用及其机制。方法将30只雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、金水宝组,每组10只。模型组和金水宝组小鼠采用去卵巢方法构建绝经后骨质疏松症模型,造模第10天开始,金水宝组给予金水宝悬液386 mg/kg灌胃,对照组和模型组给予等体积双蒸水灌胃,均1次/d,每周连续灌胃6 d,连续灌胃15周。采用micro-CT检测小鼠的股骨微结构(骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度)及骨密度,采用ELISA法测定小鼠血清I型胶原C端肽(CTX-I)、I型原胶原N端前肽(PINP)、骨碱性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平,采用Western blot法检测小鼠骨组织中低氧诱导因子-2α(HIF-2α)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组小鼠股骨微结构破坏,骨体积分数、骨小梁数量、骨密度均明显降低(P均<0.05),骨小梁分离度及血清CTX-I、PINP、BALP、TRAP水平和骨组织中HIF-2α、TRAF6蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,金水宝组小鼠股骨微结构破坏减轻,骨体积分数、骨小梁数量、骨密度均明显升高(P均<0.05),骨小梁分离度及血清CTX-I、PINP、BALP、TRAP水平和骨组织中HIF-2α、TRAF6蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论金水宝可有效改善去卵巢小鼠骨质疏松,机制可能与抑制HIF-2α/TRAF6信号通路,调节骨代谢相关。

蒙药塔布森-2对于去卵巢大鼠骨质疏松软骨细胞自噬的作用

目的:绝经后妇女的骨质疏松症是我国妇女的常见病,其发生与血清雌二醇含量的下降有关,表现为全身骨密度绝对值的下降。软骨是关节的缓冲结构,骨质疏松发生时,往往伴有软骨组织的一系列改变。本实验采取手术切除大鼠卵巢的方法来制造骨质疏松模型,来阐明复方蒙药塔布森-2干预骨质疏松的机制,蒙药塔布森-2抗骨质疏松体现了“补暖、补精-抑制赫依-固骨质、壮骨”的生物学效应。方法:选择6月龄SD系SPF级健康雌性大鼠。SD大鼠70只,随机分为7组,每组10只,分别为空白对照组,去卵巢骨质疏松模型组,蒙药塔布森-2高、中、低剂量组,中药对照组骨疏康组,阳性对照组己烯雌酚组。实验大鼠以浓度为7%的水合氯醛溶液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉,由背部进入,完整摘除双侧卵巢,止血缝合。空白对照组仅将卵巢从腹腔提出而不切除(仅切除卵巢周围少量脂肪组织)。术后10周从两组分别随机选出10只大鼠采用双能X线骨密度仪进行检测骨密度,以验证造模是否成功。术后正常饲喂12周,从第13周开始,蒙药塔布森高、中、低剂量及阳性药物组和中药对照组分别给予相应药物灌胃,给药体积均为1 mL(100 g体质量·d)。模型组、空白对照组给予生理盐水灌胃,给药体积均为1 mL(100 g体质量·d)。连续给药12周。灌胃直至第24周期满,末次给药后活体测量全身骨密度。麻醉致死大鼠,打开大鼠右侧膝关节,用刀片小心刮下附着在膝关节骨表面的关节软骨,取材后制成石蜡切片用于HE染色观察;其余软骨组织-80℃冻存,用于Western Blot免疫印迹分析。数据使用SPSS19.0统计分析软件处理,每组数据用均数±标准差(均数±标准差)的形式统计,P<0.05认为差异有显著性。结果:对比于空白对照组,中药对照组骨疏康组,阳性对照组己烯雌酚组,蒙药塔布森-2高、中剂量治疗组,模型组、蒙药塔布森-2低剂量治疗组骨密度值降低、HE染色软骨细胞数量减少、WesternBlot免疫印迹分析软骨组织内GPR30、HSP60蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组,中药对照组骨疏康组,阳性对照组己烯雌酚组,蒙药塔布森-2高、中剂量治疗组之间比较,骨密度值、HE染色软骨细胞数量、WesternBlot免疫印迹分析软骨组织内GPR30、HSP60蛋白表达,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、蒙药塔布森-2低剂量治疗组之间比较,骨密度值、HE染色软骨细胞数量、WesternBlot免疫印迹分析软骨组织内GPR30、HSP60蛋白表达,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:复方蒙药塔布森-2可以增强去卵巢绝经后骨质疏松大鼠的骨密度,抑制其骨丢失,复方蒙药塔布森-2具有明确的抗绝经后骨质疏松作用;探讨蒙药塔布森-2“补肾气、补暖、补精—抑制赫依—固骨质、壮骨”治疗骨质疏松症疗效机制,为蒙医药防治骨质疏松症研究提供新的思路。

成骨细胞来源的外泌体介导微小RNA-494影响骨质疏松症大鼠骨代谢与骨重建平衡

目的探讨成骨细胞来源的外泌体(Exo)中微小RNA(miR)-494对骨质疏松症(OP)大鼠骨代谢与骨重建平衡的影响及其机制。方法从MC3T3-E1成骨细胞系中分离鉴定Exo,并将miR-494电转至Exo,Real-time PCR测定miR-494表达水平。40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、miR-494模拟剂(miR-494)组和miR-494抑制剂组,每组10只。除对照组外,其余3组大鼠切除卵巢构建OP模型。模型制作成功后,miR-494组与miR-494抑制剂组分别接受含相应miRNA的Exo尾静脉注射,剂量为3×10^(9)个微粒。4周后,Micro-CT检测各组大鼠的骨参数,ELISA测定血清骨标志物,HE染色观察骨组织病理变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色检测破骨细胞数量,Western blotting测定骨重建相关蛋白及Toll样受体4(TLR4)相关通路蛋白表达水平。结果成功从MC3T3-E1细胞中分离得到典型杯状或圆形,直径约100 nm的Exo,其含有CD63、CD9、肿瘤易感性基因101(TSG101)、热休克蛋白70(HSP70)蛋白,且能被MC3T3-E1细胞摄取。经电转处理后,miR-494模拟剂和miR-494抑制剂的Exo中miR-494的相对表达量明显升高和降低(P<0.05)。与模型组相比,miR-494组大鼠骨参数降低,血清骨标志物骨钙蛋白(BGP)、TRACP、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)升高,骨保护蛋白(OPG)、Ⅰ型前胶原N端肽(PⅠNP)降低,骨小梁结构紊乱,破骨细胞增加,骨组织内骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Runt相关转录因子2(RUNX2)下调,核因子κB受体激活剂配体(RANKL)上调,TLR4、核因子κB(NF-κB)p65及髓样分化主要响应蛋白88(MyD88)上调(P<0.05)。而miR-494抑制剂组情况则相反,骨参数和OPG、PⅠNP升高,BGP、TRACP、CTX-Ⅰ降低,骨结构恢复正常,破骨细胞减少,骨组织内BMP-2、RUNX2上调,RANKL下调,TLR4、NF-κB p65及MyD88下调(均P<0.05)。结论Exo传递miR-494可加重OP大鼠骨代谢异常,并抑制骨重建平衡,推测其作用机制可能与调控TLR4通路有关。

有氧运动改善去卵巢骨质疏松小鼠的骨质流失

目的探讨长期有氧运动对卵巢切除骨质疏松小鼠骨质流失和氧化应激的影响,并初步探讨其对沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头盒蛋白O1(FoxO1)信号通路的影响。方法采用双侧卵巢切除法制备骨质疏松小鼠模型。将小鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(OVX组)、雌二醇组(E2组)、有氧运动组(AE组)、有氧运动+SIRT1抑制剂组(AE+EX527组),每组10只。E2组给予戊酸雌二醇1 mg/kg灌胃;AE组进行跑台训练;AE+EX527组除定期跑台训练外,给予SIRT1抑制剂EX527灌胃(5 mg/kg);Sham组和OVX组每日给予等体积生理盐水。采用Micro-CT测量小鼠股骨骨密度(bone mineral density,BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp);采用苏木精伊红染色观察股骨组织病理形态;采用酶联免疫吸附法测定骨代谢指标碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原交联羧基末端肽(CTX-I)和抗酒石酸酸性磷酸酶5 b(TRACP5b)的水平;使用二氢乙锭(DHE)染色检测骨组织活性氧(ROS)水平;采用相应试剂盒检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的水平;采用蛋白免疫印迹分析股骨组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)、叉头盒蛋白O1(FoxO1)和Ac-FoxO1蛋白表达。结果与OVX组相比,E2组和AE组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、血清ALP、SOD、GSH-Px以及股骨组织中SIRT1和FoxO1蛋白表达均明显升高,而Tb.Sp、血清BGP、TRACP5b、CTX-I、MDA水平以及股骨组织ROS水平和Ac-FoxO1蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与AE组相比,AE+EX527组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、血清ALP、SOD、GSH-Px以及股骨组织中SIRT1和FoxO1蛋白表达均明显降低,而Tb.Sp、血清BGP、TRACP5b、CTX-I、MDA水平以及股骨组织ROS水平和Ac-FoxO1蛋白表达均明显升高(P<0.05)。结论有氧运动可能通过激活SIRT1/FoxO1信号通路来抑制氧化应激,从而改善OVX小鼠的骨质流失。

鼠尾草酚调控Nrf2/HO-1信号通路介导成骨分化治疗骨质疏松症的研究

目的研究鼠尾草酚对MC3T3-E1细胞氧化应激损伤状态下成骨分化的影响及其作用机制,阐述鼠尾草酚治疗骨质疏松症的潜力。方法MC3T3-E1细胞加入不同浓度(0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μmol/L)的鼠尾草酚干预24 h,分析对成骨细胞增殖的影响,选择最佳的鼠尾草酚干预浓度进行后续实验。将细胞分为对照组(不做任何处理)、模型组(250.0μmol/L H_(2)O_(2)干预)、鼠尾草酚低浓度组(250.0μmol/L H_(2)O_(2)+2.5μmol/L鼠尾草酚)、鼠尾草酚高浓度组(250.0μmol/L H_(2)O_(2)+5.0μmol/L鼠尾草酚),各组细胞干预24 h。比较各组活性氧(ROS)、丙二醛(MDA),碱性磷酸酶(ALP)活性,矿化面积比例,Runx2、Osterix、COL1A mRNA表达及Nrf2、HO-1、SOD2 mRNA和蛋白表达。结果选择2.5、5.0μmol/L鼠尾草酚进行后续实验。与对照组比较,模型组ROS、MDA含量及Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达升高;ALP活性,矿化面积比例,Runx2、Osterix、COL1A mRNA及SOD2 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,鼠尾草酚低、高浓度组ROS、MDA含量降低;ALP活性,矿化面积比例,Runx2、Osterix、COL1A mRNA表达及Nrf2、HO-1、SOD2 mRNA和蛋白表达升高(P<0.01)。与鼠尾草酚低浓度组比较,鼠尾草酚高浓度组ALP活性、矿化面积比例及HO-1蛋白表达升高(P<0.05);鼠尾草酚低、高浓度组ROS,MDA含量,Runx2、Osterix、COL1A、HO-1 mRNA及Nrf2、SOD2 mRNA和蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论鼠尾草酚可通过激活Nrf2/HO-1信号通路调控MC3T3-E1细胞的氧化应激状态,进而促进成骨分化,减轻骨质疏松进程中骨代谢失衡。