FTIR光谱法研究天花粉蛋白的热去折叠过程

本文利用FTIR光谱技术和计算机辅助解析技术 (二阶导数、去卷积和曲线拟合 )研究了天花粉蛋白的热诱导去折叠过程。结果表明 :在 2 5～ 85℃温度范围内 ,天花粉蛋白的热去折叠是一个不可逆的分子间聚集的过程 ;二级结构随温度的变化暗示了折叠中间体的存在。

脲和盐酸胍诱导过氧化氢酶去折叠的研究

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导牛肝过氧化氢酶去折叠的过程 .当脲浓度从 0依次增大至 0 5 0 ,4 5和8 0mol/L时 ,过氧化氢酶从天然四聚体依次转变为蓬松的四聚体、部分折叠的无活性二聚体和去折叠态 ,而当盐酸胍浓度从 0依次变化至 0 65 ,2 5和 6 0mol/L时 ,过氧化氢酶则从天然四聚体依次转变为部分折叠的激活二聚体、部分折叠的单体和去折叠态 ,这表明无论是用脲还是用盐酸胍作为变性剂 ,该蛋白的变性过程都符合“四态模型” ,但这两种变性剂诱导该蛋白去折叠的途径和机制有较大差异 .实验结果表明荧光相图法可以检测蛋白质去折叠的中间态 .用等温滴定量热法研究了盐酸胍诱导过氧化氢酶去折叠过程的热力学 ,2 5 0℃时低浓度盐酸胍诱导该蛋白从天然四聚体转变为部分折叠的激活二聚体的本征摩尔构象变化焓、Gibbs自由能和熵分别为 -69 2kJ·mol-1,6 43kJ·mol-1和 -2 5 4J·K-1·mol-1,据此推断盐酸胍通过熵效应和静电效应来稳定和激活该二聚体 .

牛胰岛素去折叠过程的高效液相色谱法分析

建立了反相高效液相色谱法动态监测牛胰岛素在二硫苏糖醇存在下去折叠的过程。牛胰岛素在二硫苏糖醇作用下，首先发生构象变化，形成稳定的中间体后进一步断裂分子间的二硫键，形成Ａ链和Ｂ链。去折叠过程通过基质辅助激光解吸附质谱得到了鉴定。

脲和盐酸胍诱导溶菌酶去折叠的荧光相图法研究

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导卵清溶菌酶去折叠的过程 .当变性体系中无还原剂 2 巯基乙醇存在、脲浓度从 0变化至 4 0mol/L(或盐酸胍浓度从 0变化至 3 0mol/L)时 ,溶菌酶从天然态转变为部分折叠中间态 ,当脲浓度从 4 0mol/L变化至 8 0mol/L(或盐酸胍浓度从 3 0mol/L变化至 6 0mol/L)时 ,溶菌酶从中间态转变为去折叠态 ,此时该蛋白的变性过程符合“三态模型” .而当变性体系中有该还原剂存在时 ,溶菌酶则由天然态直接转变为去折叠态 ,此时脲诱导该蛋白去折叠的过程符合典型的“二态模型” .

毛细管区带电泳监测牛胰岛素的去折叠过程

用毛细管区带电泳监测了二硫苏糖醇作用下二硫键还原引起的牛胰岛素去折叠全过程 ,同时用离线的基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱配合确证。从毛细管电泳谱图能直接观察胰岛素去折叠过程中发生的变化 ,获得蛋白质去折叠信息。结果表明 ,毛细管区带电泳作为监测蛋白质构象变化的一种有效手段 ,方法简便、快速、灵敏度高。

压强温度耦合作用下小蛋白去折叠过程的分子动力学模拟

在不同温度(280～540K)和压强(1×102～8×105kPa)的耦合作用下,对GB1(the B1 domain ofprotein G)进行了56次独立分子动力学模拟,模拟时间达88.8 ns.在此基础上,研究了压强和温度对GB1去折叠过程的耦合效应.结果表明,压强对温度去折叠过程有明显影响,改变了蛋白质二级结构去折叠速度和蛋白质去折叠过程发生事件的先后次序.相同温度下,GB1的α-螺旋和β-折叠的稳定性随压强增大而提高;可及性表面积和其它结构特性参数随压强增大而减小.适度的压强(如2×105kPa)会抑制温度导致的GB1二级结构去折叠速度,而更大的压强(如8×105 kPa)又加速了GB1的去折叠速度.在模拟的温度范围,当压强为100和2×105kPa时,GB1疏水核协同暴露于水,而5×105和8×105 kPa时没出现此现象,这与最近的高压变性实验结果一致.

脂质氢过氧化物氧化修饰对大豆蛋白去折叠和复折叠性质的影响

以13-氢过氧化-顺-9,反-11-十八碳二烯酸(HPODE)代表脂质氢过氧化物,采用园二色谱和内源荧光光谱研究不同浓度HPODE氧化修饰对大豆蛋白去折叠和复折叠性质的影响。结果表明:复折叠过程中氧化大豆蛋白结构恢复程度随着大豆蛋白氧化程度的增加而下降;随着蛋白质氧化程度的增加,氧化大豆蛋白ΔGH2O、m以及去折叠分数为50%对应的尿素浓度([Urea]1/2)逐渐下降,表明蛋白质氧化导致大豆蛋白结构稳定性下降;蛋白质氧化还使得大豆蛋白去折叠速率增加,复折叠速率下降。

荧光相图法研究脲诱导牛血清白蛋白的去折叠过程

用荧光相图法研究了脲诱导的牛血清白蛋白的去折叠过程。实验结果表明,当变性体系中存在还原剂2-巯基乙醇时,牛血清白蛋白在脲溶液中直接从天然态转变为去折叠态,没有中间态存在,此时该蛋白的去折叠过程符合典型的“二态模型”;当变性体系中无还原剂存在时,脲浓度从0 mol/L变化至0.7 mol/L时,牛血清白蛋白从天然态转变为部分折叠中间态,当脲浓度从0.7 mol/L变化至8.0 mol/L时,牛血清白蛋白从中间态转变为完全去折叠态,此时该蛋白的变性过程符合“三态模型”。

用荧光相图法研究胃蛋白酶的去折叠过程

蛋白质折叠机理的研究是基因重组蛋白质高效生产的前提条件,对于工业化生产重组蛋白以及治疗与蛋白集聚密切相关的疾病都有重要意义。为了探索一个统一的蛋白质折叠机理,用荧光相图法分别对脲和盐酸胍诱导的胃蛋白酶的去折叠过程进行了研究。结果表明,无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,当脲浓度为0-8.0 mol/L时,脲诱导胃蛋白酶的变性过程都符合“二态模型”;而无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,当盐酸胍浓度为0-6.0 mol/L时,该蛋白的变性过程均符合“三态模型”。

动态高压微射流诱导的去折叠胰蛋白酶结构预测

采用差示扫描量热法和圆二色谱分析了动态高压微射流处理前后胰蛋白酶结构的变化,结合前期研究中动态高压微射流诱导的去折叠胰蛋白酶构象的表征,通过PyMOL、3DSMax等软件分别对天然胰蛋白酶和动态高压微射流诱导的去折叠胰蛋白酶的三维空间构象进行模拟和预测,结果表明:与天然胰蛋白酶相比,动态高压微射流处理后胰蛋白酶热焓降低,二级结构构象单元百分含量发生变化,去折叠胰蛋白酶结构更加松散。模拟的胰蛋白酶分子构象示意图更直观地显示了胰蛋白酶的活性中心、二硫键以及二级结构信息,对动态高压微射流诱导的去折叠胰蛋白酶三维结构模型变化做一初探。

大分子拥挤环境中溶菌酶的去折叠过程

【目的】研究不同大分子拥挤体系对盐酸胍诱导的溶菌酶去折叠过程的影响。【方法】以葡聚糖70（Dextran70）、菲可70（Ficoll70）、聚乙二醇2000（PEG2000）作为大分子拥挤试剂，模拟体内高度拥挤的环境，用荧光相图法研究不同大分子拥挤试剂中，有无还原剂2－巯基乙醇存征时，盐酸胍诱导溶菌酶去折叠过程的变化及其特点，探讨大分子拥挤环境对蛋白质去折叠的影响。【结果】Dextran’70、Ficoll70和PEG20003种大分子拥挤试剂对溶菌酶活性几乎没有影响。无大分子拥挤试剂条件下，溶菌酶从天然态转变为去折叠态的过程中（盐酸胍浓度为0～6．0mol／L），当无还原剂2－巯基乙醇时，溶菌酶的去折叠过程符合“三态模型”，有1个中间态；当存在还原剂2-巯基乙醇时，该变性过程则符合“二态模型”，不存在任何中间态，溶菌酶可直接从天然态转变为去折叠态。溶菌酶在大分子拥挤体系中变性时，当不存在还原剂2巯基乙醇，变性过程符合“四态模型”，存在2个中间态；而当存在还原剂2-巯基乙醇时，变性过程则符合“三态模型”，有1个中间态。【结论】：通过添加大分子拥挤试剂，增加了溶菌酶变性过程的中间态，改变了蛋白由天然态到完全去折叠态的变性过程。

脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子去折叠过程中各稳定构象态的分布和过渡

以内源荧光光谱和荧光相图法研究了脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子的去折叠过程,结果表明,当变性液中脲和盐酸胍的浓度分别约为4.0和3.0 mol/L时,卵清溶菌酶分子的去折叠过程均存在一个折叠中间态,这两个去折叠过程均符合"三态模型".在卵清溶菌酶分子"三态"去折叠过程的基础上,通过变性剂分子和卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离作用,给出了一个定量描述此去折叠过程中卵清溶菌酶分子残余活性率随溶液中脲和盐酸胍浓度变化的方程.该方程包含两个特征展开参数,一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学平衡常数k,另一个是在此过渡过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m.通过这两个特征展开参数能够定量描述脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子天然态、折叠中间态和完全展开态随变性液中脲和盐酸胍浓度的分布和过渡.

利用荧光光谱法研究脲和盐酸胍诱导谷氨酸脱羧酶的去折叠

利用荧光光谱法研究了盐酸胍和脲诱导的谷氨酸脱羧酶野生酶和突变酶K413A的去折叠过程,以探索与酶稳定性相关的构效关系。以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A在激发波长为280 nm的荧光图谱中色氨酸的最大发射峰均发生红移,色氨酸荧光强度呈现先上升再下降的趋势;以脲为变性剂时,两种酶荧光图谱中色氨酸的最大发射峰同样发生红移,但色氨酸荧光强度持续下降。无论是以盐酸胍还是以脲作为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A的去折叠过程都符合"三态模型",说明随着变性剂浓度的增加,野生型酶和突变酶K413A先从天然态转变为部分折叠中间态,并最终转变为去折叠状态。此外,考察了变性剂对谷氨酸脱羧酶活力的影响,当以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A半失活的盐酸胍浓度分别为0.4 mol×L^(-1)和0.7 mol×L^(-1),而半失活的脲浓度分别为1 mol×L^(-1)和2 mol×L^(-1)。研究表明,突变酶K413A的热力学稳定性比野生型酶更强,K413位点与GAD的结构刚性有重要联系。

血红蛋白和细胞色素c构象去折叠行为研究

利用紫外-可见吸收和荧光光谱法研究了血红蛋白(Hb)与细胞色素c(Cytc)两种血红素蛋白的去折叠行为。采用化学变性剂盐酸胍(GdHCl)和尿素(Urea)诱导两种蛋白构象去折叠,阐述了两种蛋白的去折叠机理。Hb的血红素(Heme)辅基通过与卟啉铁原子和组氨酸配位,与肽链键合的稳定性较差,在3.0 mol/L的盐酸胍作用下即发生解离。而Cyt c的Heme辅基通过卟啉与半胱氨酸形成二硫键呈现较强的稳定性,盐酸胍浓度达到6.0 mol/L也难使其发生解离。该研究为阐释蛋白构象与功能之间的关系提供了重要依据。

甜菜碱对溶菌酶去折叠热力学和复性动力学的影响

Equilibrium denaturation of lysozyme by guanidinium chloride in the presence of betaine was investigated by tryptophan fluorescence.Betaine was used as a folding aid to enhance the renaturation of denatured-reduced lysozyme, the refolding kinetic behavior was studied at a low guanidinium chloride concentration by a competitive model of first-order folding reaction and third-order aggregation.It was found that betaine could shift in the transition midpoint in the guanidinium chloride induced equilibrium unfolding experiments, indicating that betaine could improve the thermodynamic stability of lysozyme.In the presence of betaine, the aggregation rate was decreased and the refolding rate was increased, the refolding yield could be increased.

新天花粉蛋白的盐酸胍去折叠过程

本文利用荧光光谱和园二色光谱研究了新天花粉蛋白的盐酸胍去折叠过程。结果显示 :新天花粉蛋白的盐酸胍去折叠是一个只包含天然蛋白和变性终态的二态过程 ,与已经报道的天花粉蛋白的盐酸胍去折叠过程不同。

脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱和激光光散射光谱研究了脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠。实验结果表明,在脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠过程中,溶液中只含有单分子牛碳酸酐酶B和二分子牛碳酸酐酶B集聚体;二分子牛碳酸酐酶B集聚体是通过单分子牛碳酸酐酶B之间的疏水和静电相互作用力而形成的。

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行鉴定 ,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。根据其保留时间 ,分析虎纹毒素 Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为 ,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。

超氧化物歧化酶全酶和脱辅基酶胍变性时失活与去折叠的比较研究

利用紫外差吸收光谱和荧光发射光谱等监测手段研究天然铜锌ＳＯＤ（ｈｏｌｏ－ＳＯＤ）和脱铜锌ＳＯＤ（ａｐｏ－ＳＯＤ）在不同浓度胍溶液中的去折叠及活力变化．结果表明ｈｏｌｏ－ＳＯＤ和ａｐｏ－ＳＯＤ分别在４．０和２．０ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中去折叠，而分别在２．０和０．５ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中其构象尚未发生明显改变时活性几乎完全丧失．提示金属离子对维持酶的整体及活性部位构象具有重要作用，脱去金属离子的酶分子的构象特别是活性部位的构象更易受到变性剂的破坏．