基于细胞内应变评估的卵母细胞去核方法及在机器人化克隆中的应用

自1996年第一只克隆羊诞生,克隆技术就由于其在动物育种方面的巨大潜力而得到了大量关注。体细胞核移植技术是动物克隆的核心,其操作过程非常复杂,不可避免地造成细胞内损伤。通常来说,只有不到1%的重构胚胎能够发育成克隆动物,克隆的低成功率是制约其广泛应用的主要原因之一。为此,本文提出了一种基于细胞内应变评估的卵母细胞去核方法,来减少体细胞核移植中的潜在细胞内损伤,从而提高克隆成功率。首先,论文根据细胞内速度场计算细胞内应变,进而将内应变作为评价标准来优化去核操作;在此基础上,开发了一套机器人批量体细胞核移植系统,用于实现机器人化克隆。实验结果表明,本文方法将体细胞核移植后的胚胎囊胚率从10.0%提高到20.8%,并成功获得17头克隆小猪,这是世界首批由机器人完成克隆操作获得的克隆动物。对比手动核移植操作,本文将克隆成功率从平均0.73%提升到了2.50%,大幅提升了克隆效率。与此同时,基于细胞内应变的去核方法有望应用于其他生物操作,并建立一种通用的减少细胞内损伤的细胞操作规范。

水牛卵母细胞去核方法的摸索

本研究对水牛卵母细胞的去核方法进行了摸索。首先通过盲吸法去核,摸索水牛卵母细胞在体外成熟不同时间的成熟率和去核率;其次采用spindle-View系统去核,摸索用这种系统去核的最佳时间。水牛卵母细胞IVM16-18h与IVM 19-21h的成熟率之间有显著差别(43.0％vs58.2％,P<0.05),与22-24h组的成熟率之间有极显著差别(43.0％vs 68.8％,P<0.01).而去核率的情况刚好相反。随着卵母细胞成熟时间的延长,卵细胞的核与PB1的相对距离增大。在体外成熟18h,20h,22h,有较大比例(分别为72.6％、67.9％、64.0％)的卵母细胞中的核与PB1的位置较近,但当成熟时间增加到24h时,这一比例下降到57.6％(72.6％vs 57.6％,P<0.05),如采用Spindle-View系统去核则可消除成熟时间对去核率的影响,这些结果表明:1.水牛卵母细胞的成熟时间的延长不断提高,而去核率呈下降趋势;2.水牛卵母细胞成熟时间的延长会增加核与PB1的相对距离;利用Spindle-View系统可提高成熟时间较长的卵母细胞的去核率。

供体细胞、去核方法以及TSA处理对巴马小型猪手工克隆胚胎发育的影响

本文用不同的供体细胞、去核方法以及TSA处理浓度研究其对巴马小型猪手工克隆胚发育的影响,试验结果发现:克隆胚的发育率在相同代次的不同供体细胞之间,极体定向和化学辅助去核法之间均无显著性差异(p>0.05);TSA浓度为40nmol/L时克隆胚的囊胚率最高,但与对照组相比无显著性差异(p>0.05)。这说明三种供体细胞均能支持巴马小型猪克隆胚的早期发育,化学辅助和极体定向去核法均为较好的去核方法。

哺乳动物卵母细胞去核方法的研究进展

随着"多莉"羊的诞生,体细胞克隆技术近年来发展迅速,并获得了一大批克隆动物。但克隆动物的效率仍然偏低,这与克隆技术各个环节的完善程度有关,卵母细胞的去核就是其中的重要环节之一。本文对近年来常见的几种卵母细胞去核方法作了详尽的论述,以期为该领域的科研工作者提供参考。

牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较

分别采用挤压去核法、盲吸去核法和点击去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核操作,在操作时间、成功率、去核率及重组胚后期发育等方面进行比较.结果表明,去核率上,盲吸法低于其他2种方法;去核成功率上,挤压法和点压法高于盲吸法;操作耗时上,挤压法和盲吸法耗时较短;3种方法所构建的重组胚卵裂率以及囊胚发育率均差异不显著.因此,挤压去核法是一种较适合延边黄牛卵母细胞去核的有效方法.

卵母细胞去核方法及其对卵母细胞发育的影响

自1938年Spermann为研究不同发育时期细胞核的发育能力而提出的细胞核移植构想以来，核移植技术已经取得了极大的成就，特别是1997年由英国科学家Wilmut等经体细胞核移植克隆出绵羊“多莉”而带来的克隆风暴更是以迅猛之势席卷全球。

不同去核方法对猪手工克隆重构胚发育效果的影响

为探讨不同去核方法对猪手工克隆(HMC)重构胚发育效果的影响,本研究比较了盲切法,第一极体(Pb1)定位法及脱羰秋水仙碱(DM)辅助去核法3种不同的去核方法的去核效率及HMC胚胎发育的影响。结果表明:第一极体定位法和DM辅助去核法的整体去核效率显著高于盲切法去核法(P<0.05);应用0.4μg/m L DM处理卵母细胞60 min的突起率、整体去核效率显著高于其他浓度和时间处理组(P<0.05);DM辅助去核与pb1定位去核法2种不同去核方法对HMC重构胚的发育效果的影响差异不显著。本研究表明,添加适量的DM可以提高徒手克隆去核效率,且对后期重构胚发育没有显著影响。

挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响。挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著。两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法。挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效。

紫外线照射时间对孤雌激活和体外受精胚胎发育的影响

用核荧光染料 Hoechst3 3 3 42对 5组牛成熟卵母细胞染色后 ,以紫外线 ( UV)分别照射0 ,10 ,2 0 ,3 0 s和 40 s。观察和分析对孤雌激活胚胎和体外受精胚胎卵裂及体外发育的影响。结果表明 ,经 UV照射 0 ,10 ,2 0 ,3 0 s和 40 s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率分别为 80 .8% ,77.9% ,72 % ,61.4%和 45 % ,囊胚发育率分别为 3 9.2 % ,3 6.4% ,19.4% ,14 .5 %和 11.1% ;UV照射 2 0 s以上的囊胚发育率都极显著低于UV未照射和照射 10 s的卵母细胞 ( P <0 .0 1) ,UV照射卵母细胞超过 2 0 s降低了孤雌激活胚胎的体外发育潜力 ;体外受精胚胎中 ,UV照射2 0 s以上与未照射和照射 10 s组相比 ,卵裂率和囊胚发育率显著差异 ( P >0 .0 5 ) ,U V照射卵母细胞超过 2 0 s时 ,显著降低了体外受精胚胎的发育潜力。由此可知 ,卵母细胞经染色后 ,UV照射时间应控制在 2 0 s以内 ,并以照射 10 s时 。

牛体细胞核移植显微操作环节的优化

本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。

The Optimization of Decontamination Methods Selected for Contaminated Areas Used in Decommissioning of CANDU-6 NPP

The objective of this paper is to provide information for nuclear field specialists and decision makers on opportunities for minimizing radioactive wastes arising from the decontamination ＆ decommissioning of a CANDU-6 NPP. The paper proposes a method for selection of appropriate decontamination techniques which may be used at Cernavoda NPP decommissioning, equipped with CANDU heavy water reactors, based on the simulation with ProVision software. The paper has a singular focus on physical decontamination techniques and does not address other aspects of decommissioning. The physical decontamination techniques which are the best for certain areas of the CANDU-6 NPP from point of view of effectiveness and cost were determined. A unit cost for each decontamination technique was determined by relating the total cost to the average surface to be decontaminated. In conclusion, physical techniques will apply more efficiently to concrete surfaces. The chemical decontamination methods, in comparison with physical decontamination methods are. more suitable for non-porous surfaces respectively metal and are less recommended for concrete surfaces.