去泛素化酶3在肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭中的作用及机制

目的探讨去泛素化酶3(deubiquitinating enzyme 3,Dub3)在肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭中的作用以及相关机制。方法设计合成Dub3的干扰序列和对照序列,转染HepG2细胞分别作为siRNA-Control组和siRNA-Dub3组,不进行转染的细胞作为Blank组。蛋白质免疫印迹(WB)和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测Dub3的表达;MTT试验检测细胞增殖;细胞免疫荧光染色检测细胞中E-cadherin和N-cadherin的表达;WB检测E-cadherin、claudin-1、N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9、snail、slug和twist的表达;Transwell试验检测细胞迁移和侵袭。结果与Blank组和siRNA-Control组相比较,siRNA-Dub3组细胞中Dub3蛋白质和mRNA的表达降低(P<0.05)。与Blank组和siRNA-Control组相比较,siRNA-Dub3组细胞在培养48和72 h时的OD值降低;E-cadherin荧光强度升高,N-cadherin荧光强度降低;E-cadherin和claudin-1表达上升,N-cadherin和vimentin表达降低;MMP2和MMP9的表达降低;迁移和侵袭的细胞数量降低;snail、slug和twist的表达降低(P<0.05)。结论Dub3沉默可以抑制肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭,可能与下调snail、slug和twist表达有关。

去泛素化酶3在子宫肌瘤中的表达及对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨去泛素化酶3(USP3)在子宫肌瘤中的表达情况以及其对子宫肌瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法选择2017年4月至2018年7月子宫肌瘤切除手术患者56例。采用免疫组化、RT-PCR和Western blot检测USP3在子宫肌瘤组织、正常子宫肌层组织以及体外培养的子宫肌瘤细胞、子宫平滑肌细胞中的表达水平。设计合成USP3的干扰序列和对照序列,转染子宫肌瘤细胞,实验分为3组,即对照组、siRNA-Control组和siRNA-USP3组。Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖情况;流式细胞术观察细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中p53和MDm2的表达水平。结果USP3在子宫肌瘤组织中的表达水平显著高于正常子宫肌层组织(P<0.05);USP3在子宫肌瘤细胞中的表达水平显著高于子宫平滑肌细胞(P<0.05)。敲低USP3后,子宫肌瘤细胞的增殖在24 h以后明显受到抑制;凋亡率显著增加;细胞中p53的表达显著升高(P<0.05);MDm2的表达显著降低(P<0.05)。结论USP3在子宫肌瘤中呈高表达,RNA干扰技术沉默USP3可以抑制子宫肌瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,可能与抑制MDm2活性以及促进p53表达有关。

去泛素化酶3在肺癌组织中的表达及对肺癌细胞上皮间质转化、迁移和侵袭的影响

目的探讨去泛素化酶3(ubiquitin-specific protease 3,USP3)在肺癌组织中的表达及对肺癌细胞上皮间质转化、迁移和侵袭的影响。方法利用反转录-多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot等方法检测87例肺癌患者肺癌组织和癌旁组织中USP3的表达情况。将人肺癌细胞(A549)分为3组:未做处理的对照组,转染control siRNA的siRNA-control组以及转染干扰USP3的siRNA-USP3组,RT-PCR和Western blot方法检测3组细胞中USP3水平,以观察干扰效果;利用Western blot方法检测上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关的E-钙黏蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达情况;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力。结果USP3在肺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。siRNA-USP3组的A549细胞中USP3的转录和表达水平显著低于对照组和siRNA-control组(P<0.05)。E-cadherin在siRNA-USP3组的水平显著高于对照组和siRNA-control组(P<0.05),Vimentin在siRNA-USP3组的水平显著低于对照组和siRNA-control组(P<0.05)。与其他2组相比,siRNA-USP3组的划痕愈合率以及侵袭能力显著降低(P<0.05)。结论USP3在肺癌患者体内呈高水平表达,可促进A549细胞的上皮间质转化、迁移和侵袭能力。

去泛素化酶3在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞生物学特性的影响

目的探讨去泛素化酶3在人不同前列腺癌细胞株中与前列腺癌组织中的表达,以及去泛素化酶3对前列腺癌细胞增殖、迁移和上皮间质化的影响。方法采用Western Blot法和实时荧光定量PCR法,分别检测去泛素化酶3在前列腺癌细胞株和正常前列腺上皮细胞株中的蛋白和mRNA水平。以前列腺癌细胞株PC-3为研究对象,通过瞬时转染siRNA抑制去泛素化酶3的表达,然后采用MTS法和Transwell法分别检测PC-3细胞增殖和迁移能力的变化,最后通过Western Blot法明确去泛素化酶3在前列腺癌细胞中对上皮间质化关键因子Snail1的调控作用。结果Western Blot法和实时荧光定量PCR均显示去泛素化酶3在前列腺癌细胞中的蛋白和mRNA水平高于正常前列腺细胞株(P<0.05);通过siRNA抑制去泛素化酶3的表达后,PC-3细胞的增殖能力和迁移能力均明显减弱(P<0.05),而且Snail1的表达也同时下降。结论去泛素化酶3在前列腺癌中高表达,具有促进前列腺癌细胞增殖和迁移的作用,并且通过对Snail1去泛素化,可能具有增强前列腺癌细胞上皮间质化的能力,有望成为前列腺癌治疗的新靶点。

去泛素酶复合体Ubp3/Bre5的制备及与Cdc48作用（英文）

泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中.Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用.为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆菌中成功表达并纯化重组Ubp3与Bre5单体及Ubp3/Bre5复合体,首次成功大规模制备重组Ubp3/Bre5复合体.通过一系列pulldown实验,检验Ubp3/Bre5与AAA家族中泛素选择性ATP酶Cdc48的相互作用模式,结果发现,Ubp3及Bre5无法单独与Cdc48结合,但Ubp3/Bre5复合体可以有效与Cdc48相互作用.提出了Ubp3/Bre5-Cdc48相互作用的新模式,制备了高质量重组Ubp3/Bre5复合体.该研究为通过生化及结构生物学进行分子机制探索奠定了基础.

泛素羧基末端水解酶L3的研究进展

去泛素化酶(DUB)是一种能够从蛋白底物上去除泛素(Ub)的酶,参与到许多重要的生命活动之中,包括细胞生长、分化、转录调控和肿瘤发生等。泛素末端水解酶家族(UCHs)属于去泛素化酶(DUB)中的一个亚家族,包括四个成员:UCHL1,UCHL3,UCH37和BAP1。UCH家族成员在不同的疾病之中发挥不同的功能。UCHL3作为该家族中的重要成员之一,在癌症、神经性疾病、细胞的分化、成熟、发育和凋亡以及DNA损伤修复等之中发挥功能。已有研究表明,磷酸化调控UCHL3可以增强其去泛素化酶活性,但是这种磷酸化调控机制尚不清楚。本文主要综述了UCHL3的结构、功能以及其磷酸化调控方面的研究进展。

RNA干扰Dub3表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制去泛素化酶3(Dub3)基因表达对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制Dub3基因的siRNA载体片段(siRNA-1、siRNA-2)分别高效转染人鼻咽癌CNE-2细胞,同时设转染无义序列的空转染组及无任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR(q PCR)检测Dub3表达水平以筛选抑制率高的感染载体用于后续试验。噻唑蓝法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,采用Western blotting检测各组转染96 h后细胞分裂周期蛋白25A(Cdc25A)的表达情况。结果转染组的Dub3 mRNA水平均低于空转染组和对照组(P<0.05),且选择干扰效率高的siRNA-1载体进行功能学研究;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G_0/G_1期细胞比例升高,但S期和G_2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);抑制组转染后的Cdc25A水平降低,与空载体组和对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。空载体组和对照组以上指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论通过siRNA抑制Dub3基因表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对鼻咽癌的防治有一定价值。

肺癌组织中USP3及FOXF1表达与临床特征的关系及其与肺癌组织EMT标识物的相关性

目的:探究肺癌组织中去泛素化酶3(USP3)、叉头蛋白1(FOXF1)表达与临床特征的关系及其与肺癌组织上皮间质转化(EMT)标识物的相关性。方法:回顾性分析2016年1月-2019年12月南通大学附属医院收治的130例肺癌患者的临床资料,并取患者手术切除的癌组织及其周围的癌旁组织(均经病理诊断)。采用免疫组化法检测患者癌组织及癌旁组织中USP3、FOXF1的阳性表达情况;分析肺癌组织中USP3及FOXF1表达与临床特征的关系;并通过Spearman相关分析探究USP3、FOXF1的表达与肺癌组织EMT标识物上皮型钙黏附素(E-cardherin)和波形蛋白(Vimentin)的相关性。结果:130例肺癌组织标本中USP3及FOXF1阳性表达率分别为92.31%(120/130)、86.15%(112/130),癌旁组织中USP3及FOXF1阳性表达率分别为31.54%(41/130)、29.23%(38/130),肺癌组织的USP3及FOXF1阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)。不同USP3及FOXF1表达情况患者的性别、年龄及病理类型比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。不同USP3及FOXF1表达情况患者的临床分期比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。130例肺癌组织样本中Vimentin阳性81例,阳性表达率为62.31%,E-cadherin阴性90例,阴性表达率为69.23%;经Spearman分析,USP3、FOXF1与Vimentin均呈正相关,USP3、FOXF1与E-cadherin均呈负相关(P<0.05)。结论:USP3、FOXF1在肺癌组织中表达明显,与肺癌患者临床特征具有一定的联系。同时USP3、FOXF1与肺癌细胞EMT标识物具有明显的相关性,与肺癌的发展密切相关。