烤烟去甲基萘醌甲基转移酶类似基因cDNA克隆与生物信息学分析

去甲基萘醌甲基转移酶是甲基萘醌代谢途径中的最后一步关键酶,能将二甲基萘醌转化为甲基萘醌,还可以调节RNA的代谢。从烤烟品种南江3号(Nicotiana tobacum cv.Nanjiang-3)均一化cDNA文库中克隆获得1个去甲基萘醌甲基转移酶类似基因cDNA全长序列,命名为T-DM1,GenBank中的登录号为HO663886,该基因全长741 bp。利用ORF finder和ProtParam软件分析表明,它包含一个长度为501 bp的完整开放读码框,编码一个含有166个氨基酸、等电点为5.70、分子量为17.77 kV的蛋白。Blast搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-DM1基因编码的蛋白与棉花、玉米和拟南芥的去甲基萘醌甲基转移酶基因具有较高的同源性,其一致性分别为96%、86%和85%。

相转移催化氧化法制备2-甲基萘醌的研究

用溴酸钾在酸性溶剂下氧化2-甲基萘制备2-甲基萘醌。考察了相转移催化剂、反应温度、反应时间、氧化剂与原料的配比等因素对收率的影响,获得的最佳反应条件如下:相转移催化剂为四丁基溴化铵,反应温度为80℃,反应时间5h,氧化剂与原料的配比2.5∶1。2-甲基萘醌的收率为48.12%,比传统的工业生产大约高出10%。

液相氧化法制备维生素K中间体β-甲基萘醌的研究

用溴酸钾氧化β-甲基萘制备β-甲基萘醌。考察了相转移催化剂种类、反应温度、反应时间、氧化剂与原料的配比等因素对目标产物收率的影响,从而获得了最佳反应条件:相转移催化剂为四丁基溴化铵,反应温度80℃,反应时间5 h,氧化剂与原料的配比2.5∶1。在以上较优条件下,得到目标产物β-甲基萘醌的收率为48.12%。比传统的工业生产大约高出10个百分点。

白花丹醌对白血病细胞DNA甲基转移酶的作用

目的探讨中草药提取物白花丹醌对人白血病细胞系HL-60甲基化的影响机制。方法MTS法确定不影响细胞生长的白花丹醌研究浓度;白花丹醌研究浓度作用于HL-60细胞不同时间,ELISA法测定其甲基化水平和DNA甲基转移酶(DNMT)活性;实时荧光定量PCR评估DNMT酶类基因mRNA表达水平。结果选定白花丹醌0.8μmol/L作为研究浓度,作用18h,HL-60细胞甲基化水平显著下降[(1.63±0.27)ng比(2.42±0.41)ng,P<0.05],这种去甲基化作用能被活性氧(ROS)阻滞剂所逆转,使得预处理组与对照组甲基化水平无显著差异[(2.11±0.16)ng比(2.27±0.21)ng,P>0.05];白花丹醌作用12h后,与对照组比较出现DNMT总体活性的下降[(0.91±0.09)OD·h^(-1)·μg^(-1)比(1.24±0.19)OD·h^(-1)·μg^(-1),P<0.05],作用24h后活性下降更明显[(0.69±0.08)OD·h^(-1)·μg^(-1)比(1.24±0.19)OD·h^(-1)·μg^(-1),P<0.01];白花丹醌对DNMT1、DNMT3b基因的表达具有明显抑制作用(P<0.05),对DNMT3a基因的表达作用不明显。结论低浓度白花丹醌以ROS为重要介质,能够诱导白血病细胞去甲基化,这种作用与抑制DNMT活性,抑制DNMT1和DNMT3b基因的表达有关。

苯代谢物氢醌对人体肝细胞内DNA甲基转移酶基因和蛋白表达的影响

苯是一种具有致癌效应的环境污染物,氢醌(Hydroquinone,HQ)作为重要的苯代谢物,其介导的毒性可能是苯致癌的原因之一.越来越多的证据表明,DNA甲基化异常是致癌物质发挥毒作用的一种主要途径,HQ可以诱导人体肝细胞DNA甲基化水平改变,但其作用机制尚不清楚.为探索HQ诱导DNA甲基化改变的主要因素,本文应用RT-PCR和Western blotting技术,研究不同浓度HQ(0、5、10、25和50μM)染毒暴露对L02肝细胞内DNA甲基化转移酶(DNMT1,DNMT 3a和DNMT 3b)基因和蛋白表达的影响.实验结果表明,HQ可诱导三种酶的基因表达不同程度升高,高剂量组(≥10μM)与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);0~50μM范围内HQ可诱导DNMT 1和DNMT 3b的蛋白表达呈浓度依赖性增高,25和50μM实验组与对照组相比差异显著(P<0.05).这些结果表明HQ的暴露可引起L02细胞内DNA甲基化转移酶的基因和蛋白表达升高,这可能导致一些目的基因DNA甲基化发生异常,本实验从表观遗传学角度暗示了HQ影响人体早期健康的机制.

甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达

目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。

氢醌对DNA甲基转移酶表达的影响

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的分子机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmo/lL HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平。结果与对照组相比,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达量在各HQ处理组细胞中均下降,其中以20.0μmo/lL组细胞的下降最为明显,分别下降46%(P<0.05)、83%(P<0.05)和48%(P<0.05),且DNMT1和DNMT3a的表达量随着HQ剂量的增加而下降。结论 HQ致DNA整体低甲基化下调机制可能与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达异常有关。

多巴胺代谢酶基因多态性与帕金森病遗传易患性的相关性研究

目的探讨参与多巴胺代谢的儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)基因G1947→A位点突变所致的基因多态性、NAD(P)H醌氧化还原酶基因〔NAD(P)H:quinoneoxidoreductase,NQO1〕cDNA609C→T多态性与帕金森病(PD)遗传易患性的关系。方法用PCRRFLP分析COMT、NQO1基因多态性。结果COMT基因型分布频率在PD和对照组之间差异有显著意义(P=0.045)。和对照组比较,PD组野生型(G/G)和突变型纯合子(A/A)的频率分布有增高趋势,而杂合子基因型(G/A)的分布则有降低趋势。NQO1基因T等位基因频率PD组(52%)高于正常对照组(43%)。含T碱基的NQO1基因型频率PD组显著高于正常对照组(P<0.05),其患PD的相对危险度(OR)为3.8。在COMT基因型为G/G基因型的个体,带有T碱基的NQO1基因型在PD组占91.2%,对照组占64.4%,其患PD的OR值为5.7(P=0.001)。结论CCOMT基因的G/G和A/A基因型、NQO1基因的T等位基因都是PD的危险因素。CCOMT基因的G/G基因型与NQO1基因的T等位基因的基因型可相互协同,增加PD发生的风险。

氢醌对骨髓间充质干细胞PARP-1和DNA甲基转移酶基因和蛋白表达的影响

目的探讨氢醌(HQ)诱导DNA甲基化改变的分子机制。方法用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组作为对照,采用实时荧光定量-聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法检测2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L HQ染毒骨髓间充质干细胞(BMMSCs)聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)和DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因和蛋白的表达。结果 PARP-1、DNMT1基因和蛋白表达水平均随HQ染毒剂量的增加而升高,呈剂量-效应关系,基因表达的回归方程分别为y=0.030 x+1.283,y=0.075 x+1.088,蛋白表达的回归方程分别为y=0.025 x+1.234,y=0.043 x+1.097,DNMT3a基因和蛋白表达水平随剂量增加而降低,呈剂量-效应关系,基因和蛋白表达的回归方程分别为y=-0.040 x+1.151;y=-0.012 x+1.021。结论 HQ暴露导致基因组DNA甲基化的改变可能与DNA甲基转移酶表达异常有关,且PARP-1可能参与了HQ暴露致DNA低甲基化的过程。

氢醌致人支气管上皮细胞DNA甲基化改变中聚ADP-核糖聚合酶1的作用

【摘要】目的观察氢醌诱导体外细胞DNA甲基化水平改变，探讨聚ADP-核糖聚合酶l[poly（ADP．ribose）polymerasel，PARPll在该过程中的作用。方法以10、20、40、60、80μmol／L浓度的氢醌分别处理人支气管皮细胞（16HBE）及其PARPl缺陷细胞（16HBE—shPARP1）48h，对照组加入等体积的PBS溶液。采用高效毛细管电泳检测基因组DNA整体甲基化水平，检测PARP1和DNA甲基转移酶1（DNAmethvltransferases1，DNMT1）mRNA表达的变化。结果16HBE和16HBE．shPARPl细胞基因组整体甲基化百分比（mCpG％）分别为（4．89％±O．07％）和（9．53％±0．51％）。经5．氮杂脱氧胞苷（DAC）处理72h后，mCpG％值分别下降为（3．07％±0．12％）和（6．34％±0．3％），经单因素方差分析，2种细胞不同处理组mCpG％的差异有统计学意义（F值为61．25和60．36，均P〈0．01）。16HBE细胞各氢醌染毒组的PARPImRNA相对表达分别为对照组的145．0％、159．0％、169．0％、215．0％和236．0％，差异均有统计学意义（P〈0．01）；16HBE．shPARPl细胞，各氢醌染毒组PARPlmRNA相对表达水平分别为对照组的170．0％、223．0％、264．0％、327．0％和320．0％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。当氢醌染毒剂量达到20、40、60、80μmol／L，16HBE细胞DNMT1mRNA相对表达水平分别为对照组的114．0％、126．0％、136．0％和162．0％，差异有统计学意义（均P〈0．01）；当氢醌染毒剂量达10、20、40、60、80μmol／L，16HBE—shPARPl细胞DNMT]mRNA相对表达水平分别为对照组的141．0％、165．2％、186．9％、202．1％和217．3％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论氢醌能引起16HBE细胞低甲基化，PARP1可通过影响DNMT1的表达及改变DNMT1的活性来调节16HBE细胞DNA甲基化改变。

氢醌致DNA甲基化改变及可能机制

苯是一种广泛使用的工业原料,同时是一种确定的遗传毒性致癌物,主要由其活性代谢产物——氢醌发挥毒性作用。氢醌本身普遍应用于黑白显影剂、橡胶防老剂、稳定剂和抗氧剂。氢醌可引起机体多系统毒性损伤,长期试验表明氢醌还是一种致癌剂。近年来有文献报道氢醌暴露可导致DNA甲基化水平发生改变,本文综述了氢醌可能通过调节DNA甲基化转移酶的活力、氧化应激损伤干扰、DNA损伤修复蛋白调控以及其他表观遗传学修饰的参与等影响DNA甲基化状态,旨在为预防氢醌乃至苯中毒提供参考依据。