3种巯基蛋白酶对去磷酸化牛乳β-酪蛋白和茶黄素复合膜的清除

目的:采用茶黄素(theaflavin,TF)和去磷酸化牛β-酪蛋白(dephosphorylated bovineβ-casein,Dβ-CN)在芯片表面形成蛋白质/色素复合膜的模型,评估3种巯基蛋白酶(cysteine proteases,CPs),木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶,对Dβ-CN/TF复合膜的清除作用。方法:在消散石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)上建立Dβ-CN/TF复合膜,Boltzman方程评估3种CPs水解复合膜的效率,水解前后膜变化通过原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)和接触角表征。结果:3种CPs水解复合膜的效率由大到小依次为无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶(P<0.05)。AFM图和接触角表征结果证实,CPs能够有效地清除结合在Dβ-CN表面的TF。结论:CPs具有在牙色渍清除中潜在的应用价值。在开发口腔保健产品中该类酶值得进一步研究。

电泳与质谱技术联用鉴定牛乳酪蛋白分子酶法脱磷酸化修饰

牛乳酪蛋白的磷酸化程度对酪蛋白的结构、功能和营养特性等有着重要的影响。为了从分子水平上模拟人乳组成,选用合适的方法修饰调控牛乳酪蛋白磷酸化程度,并且准确检测其磷酸化程度的变化至关重要。该研究使用马铃薯酸性磷酸酶(PAP)对β-酪蛋白和酪蛋白酸钠脱磷酸化修饰,并分别运用SDS-PAGE、UreaPAGE和质谱技术联用鉴定酶法脱磷酸化修饰后蛋白中磷酸化程度的变化。实验结果表明,采用SDS-PAGE可以观测到α-、β-酪蛋白和蛋白水解情况,但不能区分不同程度脱磷酸化的酪蛋白。Urea-PAGE能较为清晰地表示不同程度脱磷酸化的酪蛋白,但不能准确鉴定不同程度脱磷酸化酪蛋白所含的磷酸基团的个数。LC-MS不仅可以清晰地表示酪蛋白脱磷酸化程度,还可以定量分析不同程度脱磷酸化酪蛋白所含的磷酸基团的个数。

荧光、紫外和红外光谱分析人乳和牛乳β-酪蛋白的功能和构象差异

β-酪蛋白是人乳酪蛋白的主要成分,但它在牛乳中的含量却很小。β-酪蛋白在两者中含量的差异,是人乳比牛乳更易消化的原因之一,研究人乳与牛乳β-酪蛋白结构和功能的差异,对研制出更适合婴儿肠道的,新型人乳模拟型婴儿配方奶粉具有指导性的意义。用紫外分光光度法研究人乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白的溶解性、巯基含量、乳化性等功能性质,用荧光光谱和红外光谱分析比较两种蛋白的结构特点。两种蛋白等电点十分接近（pH 4.0~5.0）,在等电点附近时,人乳β-酪蛋白的溶解性（10.83%）低于牛乳β-酪蛋白（11.83%）,而偏离等电点时人乳β-酪蛋白具有更高的溶解性,人乳β-酪蛋白的乳化活性指数（110~140m^2·g^-1）高于牛乳β-酪蛋白（70~130m^2·g^-1）,两种蛋白的表面巯基（SH）相似[（18.47±0.08）和（18.67±0.17）μmol·g^-1],而牛乳β-酪蛋白总巯基的含量[（47.46±0.23）μmol·g^-1]大于人乳β-酪蛋白[（26.17±0.12）μmol·g^-1],两种蛋白官能团相似,均含有β-折叠结构,人乳β-酪蛋白的氢键数量和内部的疏水性均小于牛乳β-酪蛋白。结果表明,人乳β-酪蛋白比牛乳β-酪蛋白具有更少的α-螺旋和β-折叠等二级结构,具有更疏松灵活的三级结构,同时也具有更高的分子的表面活性。

圆二色光谱、红外光谱法解析羊乳和牛乳β-酪蛋白结构及性质差异

羊乳β-酪蛋白比牛乳β-酪蛋白更容易被婴幼儿消化吸收,主要原因是二者结构的不同。目前对牛乳β-酪蛋白结构的研究较多,但对羊乳β-酪蛋白的结构以及羊乳和牛乳β-酪蛋白结构差异的研究还鲜有报道。蛋白质二级结构的信息可由光谱获得,其中圆二色光谱是利用蛋白质分子中具有光学活性的生色基团对左、右平面圆偏振光吸收不同,对蛋白质结构进行表征的方法,可以测定溶液状态下的蛋白质样品,使蛋白质构象更接近其生理状态,而且具有快速简便,对构象变化灵敏等优点;红外光谱则是利用蛋白质分子在振动过程中不同化学键或官能团对红外光吸收频率不同,对蛋白质结构进行表征的方法,可以测定固体状态下的蛋白质样品,具有扫描速度快、分辨率高、可测波长范围广、不易受蛋白质样品的分子大小和外界条件影响等优点。圆二色光谱和红外光谱已被广泛应用于蛋白质构象的研究中,但是结合使用这两种方法分析β-酪蛋白结构的研究还鲜有报道。因此,该研究采用圆二色光谱和红外光谱比较羊乳和牛乳β-酪蛋白的结构特点,并利用分光光度法对二者的巯基含量及溶解性进行了分析,从功能性质方面的不同对两种蛋白结构的差异进行更好的说明。圆二色光谱测得羊乳和牛乳β-酪蛋白二级结构中主要以无规卷曲为主,但羊乳β-酪蛋白的无规卷曲含量(50.2%±0.16%)显著高于牛乳β-酪蛋白(43.8%±0.14%),其有序结构中α-螺旋含量(2.7%±0.21%)、β-折叠含量(15.3%±0.08%)显著低于牛乳β-酪蛋白(4.3%±0.13%, 19.5%±0.12%),β-转角含量分别为31.8%±0.11%和32.4%±0.09%,差异不显著;红外光谱测得羊乳β-酪蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角含量分别比牛乳β-酪蛋白低18%~20%, 9%~10%, 0.6%~1%,无规卷曲含量比牛乳β-酪蛋白高17%~19%。对两种蛋白功能性质的研究表明,羊乳β-酪蛋白与牛乳β-酪蛋白表面巯基含量基本一致19~20μmol·g^-1,但羊乳β-酪蛋白总巯基含量[(28.35±0.13)μmol·g^-1]显著低于牛乳β-酪蛋白[(46.72±0.21)μmol·g^-1];羊乳β-酪蛋白与牛乳β-酪蛋白的等电点较为接近(pH为4~5),且在等电点附近前者的溶解性低于后者,而远离等电点时前者溶解性则高于后者。研究结果说明与牛乳β-酪蛋白相比,羊乳β-酪蛋白分子的无序性和柔韧性更高,胶束内部结构更加的柔软疏松。

牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测及核型分析

本试验用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞培养液中的β-酪蛋白,鉴定该细胞的生理功能是否正常;通过分析染色体数目及核型以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示:培养液中含有β-酪蛋白,说明该乳腺上皮细胞生理状况良好;染色体数目正常,染色体数目为60,核型与哺乳动物染色体图谱一致,说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。

两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量检测研究

分别以免血清IgG与鸡卵黄抗体（IgY）为检测抗体,建立了两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量方法.牛乳κ-酪蛋白分别免疫新西兰大白兔和临产母鸡,经亲和层析分离纯化后得到anti-κ-CN-IgG与anti-κ-CN-IgY两种抗体.两种抗体均与β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳清粉存在一定交叉反应,抗体与相应抗原进行免疫吸收后得到高特异性IgG与IgY.用吸收后的anti-κ-CN-IgG建立的间接ELISA法,当标准κ-CN质量浓度在0.098～3.125 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度具有线性关系,变异系数小于1％,回收率在99.10％～101.1％之间；用吸收后的anti-κ-CN-IgY检测κ-CN,在0.098～6.25 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度成良好的线性关系,变异系数小于2％,回收率在98％～100.8％之间.当三聚氰胺掺假量在0～20％时,两种抗体均能通过κ-CN的定量检测而实现乳品的掺假检验.

牛乳κ-酪蛋白活性多肽及其改造肽的合成和生物活性

为获得抗凝血活性更强的多肽,对牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)的十一肽(f106-116)进行设计合成并改造,采用Fmoc固相合成策略,以Wang树脂为载体,Fmoc保护氨基酸为原料,HOBT/DIC为缩合剂,TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚裂解体系脱除保护基,经RP-HPLC纯化后得到了纯度>95%的9种多肽,经ESI-MS确证其结构。将所有的合成肽进行凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)以及凝血酶原时间(PT)活性测定,结果表明,各改造肽抗凝活性皆低于十一肽,增强牛乳κ-CN的十一肽片段的疏水性,其TT活性增强。

青海牦牛乳中α_(S1)-酪蛋白的电泳研究

对 2 0 1头青海牦牛乳中αS1 酪蛋白 (αS1 CN)进行了电泳分析。结果发现 :(1 )αS1 CN有αS1 CNBB ,αS1 CNBC ,αS1 CNBE ,αS1 CNCC ,αS1 CNCE和αS1 CNEE 6种基因型 ;(2 )αS1 CN基因座受αS1 CNB,αS1 CNC 和αS1 CNE3个复等位基因控制 ,其基因频率分别为 0 0 896 ,0 631 8和 0 2 786 ;(3)青海牦牛αS1 CN有效等位基因数为 2 0 62 6个 ,基因杂合度为 0 51 5 1 8,基因纯合度指数为 0 393 9;(4)环湖型牦牛与高原型牦牛αS1 CN的多态性特征相似 ,两者之间的遗传距离很小 (3 34× 1 0 - 3) ,基因分化程度低 (0 70 % )。

酶法脱磷酸化修饰酪蛋白酸钠及其体外模拟消化

以小牛肠碱性磷酸酶修饰酪蛋白酸钠(sodium caseinate,SC)为研究对象,制备得到4种磷酸化水平的SC。采用尿素电泳、微波消解-紫外可见吸收光谱和超高效液相-电喷雾-离子化-飞行时间质谱等表征手段,从不同角度鉴定了SC的脱磷酸化程度,并在模拟婴幼儿胃、肠液中考察了不同的脱磷酸化程度对SC体外消化的影响。结果表明,SC脱磷酸化程度越高,在模拟胃液中分散程度越均匀,降解速度越快;并且在模拟肠液中进一步降解时所产生的多肽分子量越小,消化性越好。

青海牛乳中α_(s1)-酪蛋白的电泳研究

对青海省 4个品种 56 0头牛乳中的αs1 酪蛋白进行了电泳研究。结果发现 :(1)青海牛乳中αs1 酪蛋白基因座受αs1 CNB,αs1 CNC,αs1 CND 和αs1 CNE4个等位基因的控制 ,有αs1 CNBB ,αs1 CNBC ,αs1 CNBD ,αs1 CNBE ,αs1 CNCC和αs1 CNCD 6种基因型 ;(2 )在青海东部黄牛中发现一种新等位基因αs1 CNE 和一种罕见等位基因αs1 CND ;(3)在αs1 CN基因座上 ,柴达木黄牛与青海东部黄牛之间有最近的亲缘关系 ,而杂种牛与黑白花牛的亲缘关系较近。

傅里叶变换红外光谱的牛乳中α_(s)1-酪蛋白和κ-酪蛋白含量的快速检测

为了找到一种能够对牛乳中的两种主要过敏原(αs1和κ-酪蛋白)含量快速检测的方法,以河南、湖北、宁夏和内蒙古四省区的211份中国荷斯坦牛牛乳样本为研究对象,建立了基于傅里叶变换中红外光谱技术的牛乳中αs1和κ-酪蛋白含量的无损快速检测模型。首先对牛乳的原始光谱进行预分析,发现水对牛乳的光谱吸收具有很强的干扰,对水的两个主要吸收区域1597~1712和3024~3680 cm^(-1)进行分析,发现水的吸收区域1597~1712 cm^(-1)和蛋白的部分吸收区域1558~1705 cm^(-1)(酰胺Ⅰ)基本重合,通过对比去除1597~1712 cm^(-1)前后的效果,最终选择925.92~3005.382 cm^(-1)的光谱区域作为敏感波段用于后续分析。选取的全光谱经手动降维,利用MCCV剔除异常样本,分别采用标准正态变量变换(SNV)、多元散射校正(MSC)等8种预处理算法和竞争性自适应重加权算法(CARS)、无信息变量消除法(UVE)等3种特征选择算法联合建立支持向量机回归模型(SVR)。经检验,对于αs1-酪蛋白,一阶导数和CARS算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数Rc和测试集相关系数R p分别为0.8827和0.8998,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为1.1363和1.3726;对于κ-酪蛋白,一阶差分和UVE算法结合建立的SVR模型效果最优,训练集相关系数R_(c)和测试集相关系数R_(p)分别为0.8808和0.8903,训练集均方根误差RMSEC和测试集均方根误差RMSEP分别为0.5345和0.5354。研究结果表明,基于傅里叶变换中红外光谱技术建立的SVR模型可以对牛乳中的过敏原α_(s)1和κ-酪蛋白含量进行无损检测,预测效果良好,此研究弥补了国内利用光谱技术对牛乳中的酪蛋白进行无损快速检测的空白。

κ-酪蛋白多态性对水牛乳酪蛋白体外消化性及消化产物生物活性的影响

为研究κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)多态性对水牛乳酪蛋白消化特性的影响,以水牛乳κ-CN多态性为依据,对不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白进行体外模拟胃肠消化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和邻苯二甲醛(OPA)水解度法分析其在消化过程中的情况,测定消化产物的抗氧化活性和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明:水牛乳κ-CN存在AA、BB、AB、AC 4种亚型,不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白的体外消化性存在差异,AB型酪蛋白消化水解最快,其次为BB型,AB型与AC型消化速度相近;不同κ-CN亚型的水牛乳酪蛋白消化产物具有一定的抗氧化性和ACE抑制活性。各κ-CN亚型的酪蛋白消化产物对ABTS自由基清除能力差别不大;BB、AA、AB型的亚铁螯合力相当,高于AC型;羟基自由基清除能力最高的是AC型;AA、AC型对ACE抑制活性高于AB、BB型。

水牛乳β-酪蛋白基因多态性与消化性能及抗氧化性能的关联研究

本研究以水牛乳β-酪蛋白(β-CN)基因多态性分析结果为依据,从水牛乳中分离并纯化出具有活性的β-酪蛋白亚型。采用体外消化模型分析其在胃肠道中的消化性能;根据水解液的抗氧化活性来分析生物活性肽的释放。高效液相色谱法(HPLC)结果显示,水牛乳中β-CN有A和B两种等位基因。消化性能结果显示A等位基因更利于β-酪蛋白在肠道的消化,抗氧化性结果显示A等位基因的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)清除能力要优于B等位基因,但在·OH自由基清除能力和还原性能力上B等位基因更有优势。β-CN基因多态性与体外消化功能和抗氧化活性的不同密切相关。这些结果可为精准设计水牛乳功能性乳制品提供理论基础。

牛乳主要过敏原α_(S1)-酪蛋白的纯化鉴定及其多克隆抗体的制备

目的:从牛乳酪蛋白中纯化获得α_(S1)-酪蛋白并对其进行综合鉴定,以及制备特异性识别α_(S1)-酪蛋白的兔多克隆抗体。方法:采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析色谱对α_(S1)-酪蛋白进行分离纯化,利用酪蛋白的理化性质(等电点和含量)、免疫学技术和质谱技术对纯化的α_(S1)-酪蛋白进行综合鉴定,然后通过透析和冷冻干燥获得高纯度的α_(S1)-酪蛋白,最后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并分析其特异性。结果:在4种酪蛋白中,α_(S1)-酪蛋白在阴离子交换层析色谱中的出峰时间最晚、峰面积最大,在电泳图中的位置最高,最终获得纯度高达94.26%的α_(S1)-酪蛋白,得率为27.19%。免疫5次后,两只兔子的抗血清效价分别为128万和32万,抗血清除了与大豆蛋白存在轻微交叉反应(<0.25%)外,与α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、蛋清蛋白、花生蛋白均无交叉反应,表明特异性高。结论:本研究制备了高纯度的α_(S1)-酪蛋白及其高特异性的多克隆抗体,为过敏原蛋白的纯化与综合鉴定提供了思路,为α_(S1)-酪蛋白免疫学检测方法的建立提供了物质基础。

基于电化学纳米免疫传感器检测牛乳中过敏原α-酪蛋白

基于电化学生物传感技术,以壳聚糖为桥联剂,结合纳米金及辣根过氧化物酶电信号放大系统,以FcεRI受体蛋白为通用分子探头吸附抗牛乳α-酪蛋白抗体IgE,构建了一种可用于牛乳中过敏原α-酪蛋白检测的纳米金免疫传感器,并且通过时间-电流曲线对牛乳α-酪蛋白进行了验证。结果表明:牛乳α-酪蛋白-免疫球蛋白E(immunoglobulins E,IgE)互作动力学曲线符合双曲线规律,结果符合双曲线拟合标准R2≥0.95,具有类似于酶-底物互作的底物饱和效应;参考米氏常数计算得到其联动变构常数Ka值为4.096×10-12 mol/L。本研究研发的生物传感器可结合变应原的特异性IgE并实现对过敏原的超敏感检测,该检测方法灵敏度高、成本低、响应快速,可为研究变应原导致的过敏反应提供一个新的检测技术手段。

牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究进展

牛乳营养丰富,乳蛋白是牛乳中最有营养价值的成分。β-酪蛋白约占乳蛋白总量的30%,A1和A2是β-酪蛋白最常见的两种类型,其中A1型为突变型。β-酪蛋白基因多态性是受常染色体上共显性基因所控制的,可通过蛋白水平或分子水平进行检测。A1型β-酪蛋白在人体内消化酶解后可产生多种特定的氨基酸残基片段,其中β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7,BCM-7)是具有阿片活性的七肽物质,推测其可能与1型糖尿病、心血管疾病、自闭症、精神分裂症、消化功能紊乱等人体慢性非传染性疾病的发生有密切联系。本文从β-酪蛋白基因变异和分型方法、BCM-7的生成机制及其对人体健康潜在影响等方面进行了综述,为未来β-酪蛋白和A2型牛乳在乳制品行业的研究开发提供一定参考。

检测牛乳κ-酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较

试验旨在建立一种快速简单检测牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)含量的酶联免疫吸附(ELISA)方法,为解决牛乳蛋白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳κ-CN为包被抗原,以酶标抗体(HRP-IgG)为检测抗体分别建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法,并对两种检测方法进行分析比较。结果表明:对于间接竞争ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为2.5μg/mL,线性范围为62.5~1 000.0ng/mL,变异系数<2%,回收率在98.46%~101.68%;对于间接ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为1.56μg/mL,线性范围为0.098~3.125μg/mL,变异系数<1%,回收率在99.10%~101.06%。比较两种检测方法,间接竞争ELISA法检测耗时较短,抗体应用量较少,而间接法不需要包被成本较高的目标标准蛋白,相关系数也较高,但其检测体系组成成分较多,且需包被待测样品,较难组成ELISA试剂盒体系,不宜用于现场检测。因此,大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争法,不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单,可更好地用于科研实践。

牛乳β-酪蛋白多态性及其对人体健康影响的研究进展

牛乳作为一种优质的营养品广受大众喜爱,β-酪蛋白是牛乳中蛋白质的重要组成部分,是评价牛乳品质的关键指标之一,对人体健康具有重要作用。牛乳β-酪蛋白具有多种分型,研究各个分型对明确β-酪蛋白的作用具有重要意义,其中最常见的分型是A1型和A2型,其他类型较少见,因此对牛乳β-酪蛋白的研究主要集中在这两者上。本文对牛乳β-酪蛋白的分型、基因频率及与人类健康的关系等方面进行阐述,综述近年来与牛乳β-酪蛋白相关的研究进展,旨在为了解牛乳β-酪蛋白提供参考。

乳类食物中β-酪蛋白的结构及营养功能

综述了人类母乳(以下简称母乳)和牛乳蛋白质中乳清蛋白与酪蛋白比例、相应蛋白质种类、含量及其营养特点,并重点叙述了酪蛋白的亚型及结构,母乳中含量最多的酪蛋白组分β-酪蛋白的消化特性、营养价值和促进钙铁等矿物质吸收、免疫调节和肠道健康促进等生物学功能的最新研究进展。由于牛乳蛋白质在组分含量和比例与母乳的差异,乳基婴幼儿配方粉中蛋白质的调整,既要考虑乳清蛋白和酪蛋白的比例,还需要进一步精细调整蛋白质亚组分的含量和比例,是当前乃至今后婴幼儿配方食品配方创新和工艺技术研发的重要方向。

水牛乳αs1酪蛋白多态性对类蒙特利杰克半硬质干酪品质的影响

目的分析水牛乳αs1酪蛋白(αs1-cαsein)多态性对类蒙特利杰克干酪品质的影响。方法采用反相高效液相色谱法分析不同水牛乳样品αs1-cαsein的多态性,依据αs1-cαsein多态性制成半硬质类蒙特利杰克干酪,比较其在组成、质构和色差等方面的差异。结果水牛乳αs1-cαsein存在AB和BB两种表型。以混合样品为对照制成类蒙特利杰克干酪后,在干酪成份上,BB型干酪中乳脂肪含量显著低于AB型;在质构方面,BB型干酪的硬度和弹性分别为41.21 N和6.3 1 mm,显著高于AB型(29.45 N,5.56 mm)和混合组(38.21 N,5.25 mm),此外BB型具有更高的胶粘性和咀嚼性;在色泽方面,BB型干酪的B值显著低于AB组,表明黄色程度低于AB型。结论水牛乳αs1-cαsein存在多态性,且αs1-cαsein的多态性会影响类蒙特利杰克干酪的品质。