去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的 探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。 方法 经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。 结果 猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。 结论 猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。

去细胞猪主动脉瓣膜的生物力学和组织相容性研究

组织工程心脏瓣膜的构建需要良好的支架结构作为细胞生长和附着的载体 ,本研究探讨了去细胞后猪主动脉瓣瓣叶的生物力学性能和组织相容性 ,发现该去细胞方法可以完全去除瓣叶内的细胞成分 ,且去细胞后瓣叶的组织含水量增加 ,可溶性蛋白含量下降 ,而瓣叶的热皱缩温度、厚度、断裂伸长率和断裂强度均未发生明显变化。幼兔皮下埋植试验证明 ,宿主细胞可以沿纤维框架的纹理长入到瓣膜内。说明该去细胞瓣叶具有足够的力学强度和组织相容性 ,可用于构建组织工程心脏瓣叶。

去细胞猪主动脉瓣移植于犬腹主动脉内构建组织工程瓣

目的 探讨在犬腹主动脉内构建组织工程心脏瓣膜的实验方法。方法 将预种犬血管间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶 (猪瓣 ),移植于 6条犬的腹主动脉内,于术后 4, 6, 8和 10周对移植瓣叶进行形态、组织结构及免疫组化染色观察。结果 (1)移植术后 4周时瓣叶周边有多层细胞长入,新细胞外基质形成,原支架组织部分吸收。(2) 10周末猪瓣组织完全吸收,为宿主细胞及新合成的细胞外基质取代。基质中间质细胞主要为成纤维细胞和肌纤维母细胞。细胞外基质成分主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原和少量弹力纤维,并含有中性和酸性黏多糖。( 3 )内皮细胞覆盖于瓣叶表面。结论(1)移植于犬腹主动脉内的去细胞猪瓣于移植术后 10周末基本构成组织工程瓣叶; (2)腹主动脉内异位移植是一种可供选择的实验研究方法。

基于迈克尔加成反应构建抗血小板黏附的去细胞猪主动脉瓣膜复合支架

目的对去细胞猪主动脉瓣膜(DPAV)进行聚乙二醇(PEG)改性,构建血液相容性好的复合支架(PEG-DPAV)。方法基于固相有机合成理论对去细胞瓣进行巯基化修饰利用巯基-丙烯酸酯发生的迈克尔加成反应,使引入到DPAV中的巯基与4-arm-PEG-acrylate中的丙烯酸酯共价结合,全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)对PEG化的DPAV进行表征。复合支架血小板黏附实验评价其血液相容性,CCK-8法检测复合支架浸提液对大鼠内皮细胞增殖率的影响,评价其细胞毒性。结果 PEG-DPAV ATR-FTIR光谱:除出现DPAV特征峰外还出现PEG特征信号峰:1100,1342,C-O,-C-H2振动峰,证明DPAV成功接枝上PEG。复合支架和DPAV毒性评级均0级,和阴性对照组差异无统计学意义。大鼠内皮细胞经含浸提液的培养液培养后形态良好,增殖旺盛,复合支架表面血小板黏附数量较少,无聚集。结论利用迈克尔加成反应成功将PEG交联到DPAV上,反应条件温和,改性效果确切。复合支架表现出良好的血液相容性,无细胞毒性,适合组织工程心脏瓣膜支架的构建。

原花青素处理去细胞猪主动脉瓣细胞相容性研究

目的观察原花青素处理去细胞猪主动脉瓣的细胞相容性。方法采用L929细胞经原花青素处理去细胞猪主动脉瓣浸提液培养后，噻唑蓝（MTT）比色法以100％、50％、25％浸提液组培养L929细胞测定其相对增殖率；将L929细胞与原花青素处理去细胞猪主动脉瓣直接接触培养，逐日观察细胞生长状态；将L929细胞种植于原花青素处理的去细胞猪主动脉瓣表面，扫描电镜观察其生长。结果100％、50％、25％浸提液组培养L929细胞相对增殖率（RGR）在87．5％-111．5％之间，与阳性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），原花青素处理去细胞猪主动脉瓣性质稳定，细胞毒性程度为0—1级。L929细胞与心包材料直接接触培养生长良好，形态学无明显改变。结论原花青素处理去细胞猪主动脉瓣细胞相容性好。

枝状化聚乙二醇修饰的去细胞猪主动脉瓣膜内皮化的性能研究

目的观察枝状化聚乙二醇（PEG）修饰后的去细胞猪主动脉瓣（DPAV）的内皮细胞生长性能。方法自合成枝状化聚乙二醇（4-arm—PEG—acrylate），采用核磁共振氢谱（1HNMR），对复合物进行表征检测，利用4-arm。PEG．amylate上的丙烯酸酯与巯基化的DPAV结合对其进行PEG化，体外获取人脐静脉内皮细胞，以细胞密度为1X10。接种于各组瓣膜支架材料上，8d后MTS试剂、苏木素-伊红（HE）染色、扫描电镜（SEM）评价内皮细胞的生长。结果。HNMR（D2O）：3．51～3．86ppm处PEG信号峰，4．14（4H，CH，OAr），5．80～6．48ppm处丙烯酸酯双键。SEM可见枝状化㈨（；修饰的DPAV胶原纤维交联增粗，人脐静脉内皮细胞在DPAV上种植8天DPAV组细胞数为（0．88±0．03）×105／cm，PEG—DPAV组细胞数为（1．18±0．04）×105／cm2，PEG—DPAV组高于DPAV组（P〈0．05）。HE染色和SEM可见两组瓣膜支架表面仅有散在的细胞存在，呈梭形或不规则形，细胞数PEG—DPAV高于DPAV组，部分可见细胞问连接紧密形成一层近似融合的细胞层，但细胞紧惭连接不连续。结论枝状化PEG修饰的去细胞猪主动脉瓣膜能够提高内皮细胞的黏附增殖，但卸不能在去细胞瓣膜支架表面形成一层完整的融合层，因此PEG化的瓣膜并不能达到理想的内皮化，有必要进行进一步修饰。

去细胞猪主动脉瓣膜超微结构及生物相容性研究

目的 观察曲拉通X-100（Triton X-100）与脱氧胆酸钠（SD）对猪主动脉瓣的去细胞效果,探讨去细胞猪主动脉瓣膜超微结构及其生物相容性.方法 分别采用1％ Triton X-100和1％SD对猪主动脉瓣进行去细胞处理,通过苏木素-伊红（HE）、Van Gieson染色,扫描电子显微镜从组织学上对去细胞瓣观察,通过血小板黏附实验和细胞毒性实验评价去细胞瓣的生物相容性.结果 1％SD去除细胞完全,细胞外基质保存完整,但去细胞瓣膜血小板黏附严重且具有一定的细胞毒性,24h和48 h的细胞相对增殖率分别为（80.29±2.05）％和（75.44±3.22）％;1％ Triton X-100去除细胞不完全,血小板黏附严重,也具有一定的细胞毒性,24h和48 h的细胞相对增殖率分别为（88.05±1.82）％和（82.95 ±3.07）％.结论 1％SD联合核酸酶对猪主动脉瓣的去细胞效果优于1％ Triton X-100,但均不够理想,其他无毒环保的去细胞试剂有待进一步探索.

异种(猪)去细胞真皮基质与自体微粒皮及自体刃厚皮复合移植的比较研究

目的 比较异种 (猪 )去细胞真皮基质 (PADM)与自体刃厚皮、PADM与自体微粒和同种异体皮以及自体微粒皮加同种异体皮覆盖烧伤创面后愈合质量的差异。方法 72只SD大鼠背部全层皮肤缺损创面分别用PADM +自体刃厚皮 (实验组I)、PADM +自体微粒皮 +同种异体皮 (实验组II)和微粒皮 +同种异体皮 (对照组 )覆盖 ,术后定期观察创面愈合情况并计算植皮成活率和收缩率 ,同时行组织学观察。结果 实验组I、II复合皮外观较平整 ,植皮成活率高 ,收缩程度轻 ,与对照组比较差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ,且实验组I创面愈合情况优于实验组II。组织学观察实验组I、II上皮化良好 ,胶原纤维排列有序 ,基底膜结构完整。结论 异种 (猪 )去细胞真皮基质与自体刃厚皮覆盖烧伤创面后愈合质量最佳 ,异种 (猪 )去细胞真皮基质与自体微粒和同种异体皮覆盖烧伤创面后愈合质量次之 ,但明显优于微粒皮加同种异体皮组。

移植异种(猪)去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的可行性:12个月随访

背景:深度烧伤患者需要进行植皮治疗,以往的自体皮移植存在皮源不足的问题。目的:探讨异种(猪)去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的可行性。方法:纳入41例深度烧伤患者,按照患者意愿分为2组,对照组21例,实施自体刃厚皮移植治疗,观察组20例,实施自体刃厚皮联合异种(猪)去细胞真皮基质移植治疗。移植后随访12个月,观察患者移植后1,2,3,4周的植皮成功率和移植后3,6,9,12个月的植皮收缩率以及创面修复情况,以及移植后1,2,3个月的炎性因子水平,并进行比较。结果与结论:(1)植皮成功率:对两组患者移植后1,2,3,4周的植皮成功率进行差异无显著性意义(P>0.05);(2)植皮收缩率:移植后3,6,9,12个月植皮收缩率比较差异无显著性意义(P>0.05);(3)炎性因子水平:移植后1,2,3个月对两组的炎性因子水平进行检测,不同时间点均无明显改变,且各时间点两组相关炎症检测各项指标水平差异无显著性意义(P>0.05);(4)随访结果:对两组患者进行12个月的随访观察,对照组创面部位未出现严重的瘢痕增生,触之质地柔软;观察组3例早期出现局部色素沉着现象,随时间延长逐渐消退;均未出现明显的瘢痕,仅存在细小、点状瘢痕,修复创面触之柔软;(5)不良事件:两组治疗过程中均未出现不良事件,无死亡病例;(6)结果表明:自体刃厚皮联合异种(猪)去细胞真皮基质移植治疗深度烧伤患者可获得理想的创面修复效果,可改善创面愈合质量,是一种安全有效的修复方案。

重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域对骨髓基质干细胞黏附力的影响

目的:研究增强骨髓基质干细胞黏附力的方法。方法:去细胞猪主动脉瓣叶分别用纤维连接蛋白(Fn)和重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCTD64)及牛血清白蛋白(BSA)浸泡预涂处理12 h,对照组未预涂蛋白。采用间隔24 h、3次种植的方法种植骨髓基质干细胞(BMSCs),于种植后第8天进行细胞计数及MTT法检测比较去细胞瓣叶上黏附、增殖的细胞数量,同时取瓣叶进行组织学检测观察瓣叶表面BMSCs覆盖情况。结果:采用预涂Fn和FnCTD64后的去细胞猪主动脉瓣叶,预涂Fn组的细胞计数为(9.085±0.622)×104,MTT的吸光值为0.537±0.022;预涂FnCTD64组的细胞计数为(9.111±0.607)×104,MTT的吸光值为0.540±0.025;预涂BSA组的细胞计数为(4.593±0.464)×104,MTT的吸光值为0.360±0.018;对照组的细胞计数为(4.460±0.441)×104,MTT的吸光值为0.353±0.019;前两组明显高于后两组(P<0.01)。预涂Fn组和FnCTD64组无显著性差异。瓣叶经H-E染色,可见预涂Fn和FnCTD64组细胞覆盖情况优于预涂BSA组和对照组。结论:Fn和FnCTD64能明显增加BMSCs在去细胞猪主动脉瓣叶表面的黏附和增殖。

改良去细胞方法对猪源性逆转录病毒的影响

目的观察改良的去细胞方法对猪主动脉瓣膜的猪源性逆转录病毒的影响。方法用0.1%胰酶消化猪主动脉瓣后,再用TritonX100DNA酶/RNA酶洗脱消化,结合溶液渗透压改变等去除细胞;取新鲜猪瓣、猪外周血标本和去细胞猪瓣各20只,降主动脉内移植去细胞猪瓣后的犬外周血10例,以PK15细胞系为对照,采用PCR和RTPCR法检测猪源性逆转录病毒。结果经去细胞处理后猪瓣内的细胞成分完全去除,纤维支架和力学性能保持良好;新鲜猪瓣及猪外周血标本均检测到219bp的扩增条带,与Medline公布的猪源性逆转录病毒有90%～95%同源性;去细胞猪瓣及移植了去细胞猪瓣犬的外周血,均未测到该病毒。结论改良的去细胞方法可以去除猪心瓣膜的猪源性逆转录病毒,能够有效预防该病毒物种间的交叉感染。

活性真皮基质的研制及生物学活性检测

目的构建含有成纤维细胞(Fb)-胶原-猪去细胞真皮基质(PADM)的活性真皮基质。研究培养液中转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌情况。方法将Fb与胶原混合种植于PADM的表面,收集第2、4、6、8、10d培养液样本,双抗体夹心ELISA法测定其中TGF-β1、bFGF的含量。结果Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质。TGF-β1和bFGF浓度培养第4天与第2天比较显著上升(P<0.01),并达到稳定水平。结论Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为构建组织工程全层皮肤的真皮支架。

异种(猪)去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的临床应用

目的观察异种(猪)去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的临床效果。方法临床选取40例深度烧伤患者,同一患者不同创面分别使用异种(猪)去细胞真皮基质+自体刃厚皮(复合皮组)和自体刃厚皮(对照组)覆盖切痂创面,术后定期行创面愈合率和收缩率比较,同时行组织学观察。结果复合皮组创面愈合良好,两组创面愈合率比较无统计学差异;但复合皮组皮肤弹性较好,收缩率显著低于对照组;组织学观察复合皮组真皮胶原纤维排列有序,基底膜结构完整。结论异种(猪)去细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植于深度烧伤切痂创面,可改善创面愈合质量。