乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品的研制

目的建立乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对24份病原体培养物的复核、确证,全基因组测序及基因分型,组成乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室的协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品由10份阴性、14份阳性、1份最低检出限和1份精密度样品组成。质量标准为10份阴性参考品应均检出阴性;14份阳性参考品应至少检出13份阳性;精密度考品重复检测10次,要求均为乙型脑炎病毒阳性,且其检测值的CV应不大于5.0%;最低检出限参考品要求1∶102倍稀释及以上浓度时应为乙型脑炎病毒阳性。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论该参考品可用作乙型脑炎病毒核酸检测试剂的质量控制及评价。

创伤弧菌核酸检测试剂国家参考品的建立

目的建立创伤弧菌核酸检测试剂国家参考品并制定质量标准,用于该类试剂的质量评价。方法收集培养多种创伤弧菌及其他弧菌病原体,经菌落鉴定、16s rRNA测序分析及实时荧光定量PCR试剂检测后筛选出18份样本,稀释、分装后组成创伤弧菌核酸检测试剂国家参考品。邀请不同的实验室对参考品进行协作标定,并对参考品进行均匀性和稳定性考察。结果建立的国家参考品,包括8份阳性参考品P1~P8、10份阴性参考品N1~N10、1份重复性参考品R和1份检测限参考品L;L使用菌落计数法测定浓度为1×10^(8)CFU/mL。4家实验室参与了国家参考品的协作标定,并根据结果制定质量标准为阳性符合率8/8,阴性符合率10/10,检出限要求至少为1×10^(3)CFU/mL及以上阳性,重复性要求检测10次均为阳性,且Ct值或定量值变异系数不大于5.0%。国家参考品均匀性检测的Ct值变异系数均不高于5%,符合要求;在2~8℃冷藏条件、室温放置7天,均未影响参考品稳定性。结论成功建立了创伤弧菌核酸检测试剂国家参考品,可用于企业试剂研发的质量控制及评价。

河流弧菌核酸检测试剂国家参考品的建立

目的 建立河流弧菌核酸检测试剂国家参考品并制定质量标准。方法 收集并筛选河流弧菌核酸阳性和阴性临床分离株样本,建立河流弧菌核酸检测试剂国家参考品。使用不同试剂对参考品进行协作标定,并对参考品稳定性和均匀性进行考核。结果 河流弧菌核酸检测试剂国家参考品由20份样本组成,包括8份阳性参考品P1~P8、10份阴性参考品N1~N10、1份检测限参考品L和1份重复性参考品R,L经菌落计数法测定浓度为1×10^(8)CFU/mL。国家参考品的质量标准为阳性符合率8/8,阴性符合率10/10,检测限要求1∶104稀释或更高浓度时应均为河流弧菌阳性,重复性要求对稀释后的两个浓度水平的Ct值的变异系数(CV,%)均不大于5.0%。经过随机抽样检测,参考品均匀性符合要求,在2~8℃冷藏条件、室温放置7天均未影响参考品稳定性。结论 本研究研制了河流弧菌核酸检测试剂国家参考品,并制定了其质量标准,可用于相关定性检测试剂的质量评价。

副溶血弧菌核酸检测试剂国家参考品的建立

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种兼性厌氧的革兰氏阴性嗜盐菌、多形态球杆菌,其菌体呈弧状、杆状或丝状,无芽孢且无荚膜。由于在我国海产品检出率较高,引起食物中毒的比例较大,因此是我国一种重要的食源性病原菌。副溶血弧菌引起的食源性疾病在临床上以呕吐、腹痛、腹泻及水样便为主要症状,少数情况下诱发败血症[1]。副溶血弧菌引起疾病的致病因子主要有溶血素,即耐热性直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、耐热性直接溶血素相关的溶血素(TDH related hemolysin,TRH)和不耐热性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH),但这些致病因子在副溶血弧菌致病过程中的作用机制还缺乏系统深入的认识[2]。

白喉棒杆菌核酸检测试剂用国家参考品的研制

目的:研制白喉棒杆菌核酸检测试剂用国家参考品。方法:将6株白喉棒杆菌和10株非白喉棒杆菌代表性菌株在各自适宜的环境下培养,经菌株鉴定后,制备灭活菌液,对候选参考品进行均匀性和稳定性的评估以及准确性、特异性、重复性和最低检出限的验证研究,并组织3家实验室进行协作标定。结果:研制出白喉棒杆菌核酸检测试剂用候选参考品,由6个阳性参考品、10个阴性参考品、最低检出限参考品和重复性参考品组成。证实该候选参考品均匀性及稳定性良好,准确性、特异性及重复性好,最低检出限可达1.0×10~3~1.0×10~4个菌·m L^(-1)。协作标定结果也进一步表明阳性、阴性、重复性和最低检出限候选参考品均符合国家参考品的各项要求。结论:研制出的白喉棒杆菌核酸检测试剂参考品,可用于相关试剂盒的质量控制和评价。

第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品的研制

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一个小的环状双链-DNA病毒,属于乳头瘤病毒家族。主要感染皮肤、生殖器和上呼吸道的表皮细胞。目前,大约200多种HPV型别被鉴定发现[1]。HPV的基因组长约为8000 bp,主要分为三个区:早期基因、晚期基因和长调控区。早期基因编码6个早期蛋白,包括E1、E2、E4、E5、E6和E7,主要负责病毒的转录和复制。其中,E6和E7基因编码与细胞癌变转化相关的蛋白。晚期基因L1和L2主要负责编码衣壳蛋白[2]。根据其与癌症的相关性,分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)。目前,将14种HPV型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)定为HR-HPV,4种HPV型别(26、53、73、82)列为潜在HR-HPV。HR-HPV的持续性感染是造成宫颈癌及多种生殖道癌症的主要病原体。在中国,69.1%的宫颈癌病例为HPV16和HPV18感染,14.7%为HPV31、33、52、58和59。HPV39、45和56占宫颈癌的4.5%,剩余的病例是比较少见的其他型别,如HPV66[3]。

脊髓小脑共济失调Ⅲ型atxn3基因变异检测国家参考品的研制

目的 研制脊髓小脑共济失调Ⅲ型atxn3基因变异检测国家参考品。方法 通过对脊髓小脑共济失调Ⅲ型atxn3基因变异外周血进行EB病毒(EBV)转染、细胞扩繁培养,完成永生化细胞的建系工作。提取atxn3基因的脱氧核糖核酸(DNA)并稀释浓度至50 ng/μL后分装,经5个协作标定单位采用实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)、PCR-毛细管电泳法对国家参考品的阳性符合率、阴性符合率、最低检出限、冻融稳定性和均匀性指标进行检测。结果 成功研制包含4个阳性样本和6个阴性样本的脊髓小脑共济失调Ⅲ型atxn3基因变异检测国家参考品。全部阳性样本及4种野生型样本的碱基排列与样本的CAG重复数一致且核酸质量合格,5家协作标定实验室的实验结果与参考品标示值一致。该参考品阳性符合率为100%、阴性符合率为100%、最低检出限阳性结果均检出、最低检出限阴性结果均未检出、冻融稳定性相关系数为0.999 9、均一性相关系数为1.000 0。结论 脊髓小脑共济失调Ⅲ型atxn3基因变异检测国家参考品的全部性能指标均符合规定,适用于atxn3基因变异体外诊断试剂盒的性能评价及质量控制。

乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家参考品的研制

目的:研制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)RNA检测试剂国家参考品并制定其质量标准。方法:收集并筛选HBV RNA阳性和阴性血浆样本,制备HBV RNA候选参考品。采用不同企业的试剂进行协作标定,根据协作标定结果确定参考品的组成及制定质量标准,并考察其均匀性和稳定性。结果:HBV RNA检测试剂国家参考品由10份阳性参考品,10份阴性参考品,1份精密度参考品和1份灵敏度参考品组成。其质量标准:阳性参考品符合率为10/10;阴性参考品符合率为10/10;精密度参考品稀释10倍后重复检测10次,要求CV≤5%;最低检测限不高于2.1×10^(3)U·mL^(-1)。该参考品均匀性符合要求,室温(25℃)放置3 d、反复冻融3次均未影响参考品的稳定性。结论:研制了首批HBV RNA检测试剂国家参考品并制定了质量标准,为相关试剂的质量控制和评价提供依据。

鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品的研制

为研制鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品,本研究制备了6份F1抗体阳性参考品、8份F1抗体阴性参考品、1份最低检出限参考品和1份重复性参考品,组成了鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品。对参考品进行均匀性检查及稳定性评估,并组织4家实验室进行协作标定。结果显示,参考品均匀性及稳定性良好。协作标定结果显示,6份阳性参考品阳性率均为100%;8份阴性参考品阴性率均为100%;最低检出限参考品的检出水平介于1~100倍稀释度;重复性参考品检测结果一致(其中酶联免疫法及上转发光法试剂检测结果的变异系数均小于15%)。结果表明,本研究建立的鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品基本符合体外诊断试剂参考品的要求,可用于相关试剂的质量评价。

鼠疫耶尔森菌基因分型国家参考品研制

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病,以发病急、传播快、病死率高为特征,对人类社会影响巨大。鼠疫主要在啮齿类动物中引起原发性感染,病原菌经鼠蚤传播给人,其引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫3种类型。其中肺鼠疫发病迅猛,可通过空气在人间传播,病死率极高[1]。人类历史上曾发生过三次鼠疫大流行,造成上亿人死亡。时至今日,很多地区,如非洲、亚洲、美洲,仍将鼠疫视为可能会死灰复燃的烈性传染性疾病之一[2-4]。

甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品的建立

目的建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,制订其质量标准,用于该类试剂的质量评价。方法通过对200多份单采浆站收集到的血浆进行初筛,筛选出16份备选样本。经多家实验室协助标定,分析标定结果,确定参考品的组成及其质量标准,并对参考品稳定性进行评估。结果本参考品由10份阴性参考品、1份最低检出限参考品和重复性参考品组成。质量标准为10份阴性参考品符合率(-/-)应为10/10,最低检出限参考品要求1:40稀释时检测阳性,重复性参考品要求1:15稀释时连续检测10次,结果应均为阳性,且显色度均一。稀释血浆应均为HCV、HBV和HIV标志物阴性。参考品在4℃放置3、7 d和反复冻融2次条件下相对比较稳定。结论成功建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,可用于该类试剂的质量控制及评价。

结核分枝杆菌微滴数字PCR检测试剂盒企业参考品的研制

为实现结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒的质量检验,研制了结核分枝杆菌微滴数字PCR检测试剂的企业参考品。将结核分枝杆菌减毒株H 37 Ra、BCG、耻垢分枝杆菌与海分枝杆菌分别在适宜的培养条件下培养,收集新鲜且充分混匀的培养物,计数后灭活、稀释和分装,对参考品进行稳定性评估。使用结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行验证,研制出了一套专用于微滴数字PCR检测试剂的企业参考品,其由2份结核分枝杆菌灭活菌液组成阳性参考品、2份非结核分枝杆菌灭活菌液组成阴性参考品,最低检出量参考品由10^(3)、10^(2)、10^(1)、10^(0)CFU/mL的结核分枝杆菌(灭活H 37 Ra)菌液组成,精密性参考品由10份10^(2)CFU/mL的结核分枝杆菌(灭活H 37 Ra)菌液组成,可稳定保存,用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒(微滴数字PCR法)的质量评价。本参考品具有较好的准确性、特异性及重复性。

产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品的研制

目的研制产气荚膜梭菌(CP)核酸检测试剂国家参考品。方法通过对5株产气荚膜梭菌和7株非产气荚膜梭菌的菌种检定、培养、灭活及分装,组建产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品。对参考品进行样品均匀性以及稳定性评估验证,组织3家实验室协作标定。结果参考品由5份阳性参考品、7份阴性参考品、3份重复性参考品以及1份最低检出限参考品样本组成,均匀性和稳定性良好。协作标定结果显示:5份阳性参考品检测结果均为产气荚膜梭菌阳性;7份阴性参考品检测结果均为产气荚膜梭菌阴性;重复性参考品检测结果全部为气荚膜梭菌阳性(n=10,CV≤5.00%);参考品最低检出限为1.0×10^(3)个菌/mL。结论建立了产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品,建立的国家参考品可用于产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒的质量控制。

第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品。方法从国内13省市几十万名供血员中筛选样品,用多种试剂对收集到的2000多份血样进行复检,从中选出317份样品,用国外3种抗-HCV EIA试剂及国内4种抗-HCVEIA试剂进行检测,对可能被选入参考品的样品,再用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂,HCV RNA PCR试剂和CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证。利用HCV基因分型试剂对部分样品进行HCV基因型别检测,并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法确证。21个实验室会同标定。结果建立了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品及相应的质量标准。结论自2004年10月1日起,第5套抗-HCV国家参考品已被国家有关部门批准正式使用。

第3代丙肝试剂国家参考品的研制及初步应用

筛选全国 14个省、市、自治区的 2 5 0 0 0多份血样 ,取其中 2 6 4份用国产 14种抗HCVEIA试剂 ,国外 2种第 3代抗HCVEIA试剂复检 ,用RIBAHCV 3.0和PCR试剂确证。经两轮会同标定 ,国外两个实验室复核 ,确定40份阳性、40份阴性样品组成第 3代丙肝试剂国家参考品。 40份阴性样品中包括国内外几十种试剂曾经出现过非特异假阳性反应的阴性样品以及其S C值较高的阴性样品。 40份阳性样品中 ,6 5 %为弱阳性样品 ,有的样品含有全谱的抗HCV抗体 ,有的样品含有某几种抗HCV抗体 ,有的样品以抗HCV某种蛋白抗体成分为主 ,还有的样品只含有某种特定的抗HCV蛋白抗体。该参考品已通过专家鉴定并经卫生部批准使用。经改进后达到第 3代参考品标准的国产试剂的临床考核说明 ,该参考品促进了国产试剂质量的提高 ,并达到国际先进水平。

人类免疫缺陷病毒抗体EIA检测试剂质控参考品的建立

以国际抗－HIV质控参考品为参比，用亚塔、阿克苏、UBI、普生、万芬等国内外试剂对41份执－HIV阳性和阴性人血浆进行筛查，并进一步以免疫印迹法确证，建立了我国第一代抗－HIV检测试剂质控参考品，其中包括阳性、阴性、灵敏度和精密性参考品。用本品对91批次国产试剂进行检测并与国外试剂进行对比，证明有较好的分辨力。在此基础上制定出我国抗－HIV检测试剂质量标准，此标准及参考品已获国家批准。

HIV抗体国家参考品(胶体金类试剂)的建立及其应用

目的建立HIV抗体国家参考品(胶体金类试剂)并对其应用效果进行分析。方法通过对阳性和阴性样品的筛选,确定候选参考品的组成,经标定,确定参考品的质量标准,并以此为标准对试剂的质量进行检测和评估。结果参考品由20份阳性、20份阴性、3份最低检测限和1份精密性样品组成。质量标准为20份阳性样品,应均为阳性,20份阴性样品中应至少18份为阴性,最低检测限样品应至少1份为阳性,且稀释用血浆应为阴性,精密度样品检测10次,其颜色反应一致。共检测进口注册、国内注册以及常规检定样品189批,其中进口注册样品合格率为81.8%,国内注册样品合格率为80.8%,常规检定样品合格率为96.2%。结论该参考品可反映试剂的质量水平,对保证试剂的质量具有重要作用。

重组葡激酶活性测定参考品的研制

按照标准品的要求研制了重组葡激酶活性参考品 ,经检测外观、无菌、水份等各项指标均符合标准品的要求 ,其活性经过 15次标定 ,结果为 (10 10± 191) U/ dose,变异系数为 19%。本品稳定性良好 ,可以作为重组葡激酶活性测定参考品。

丙氨酸氨基转移酶参考品定值方法的初步研究

目的 研究丙氨酸氨基转移酶参考品活性浓度的定值。方法 用IFCC推荐的方法测定该酶活性浓度,从9个厂家生产的试剂盒中选择3种,首先进行实际K值的测定,然后对该参考品定值。结果 瓶间变异CV小于1.0％。丙氨酸氨基转移酶的催化浓度以95％可信限赋值,复溶的冻干参考品为201±4.9U/L。结论 该定值对于本品的试用和认证是有价值的。

重组水蛭素生物学活性检测参考品的制备和标定

目的制备重组水蛭素(Hirudin)生物学活性检测参考品,并标定其生物学活性。方法按照WHO相关规定制备、分装和冻干参考品,经全面检测合格,用TH生色底物法进行体外生物学活性检测。结果外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%。经过10次标定,平均生物学活性为12 701 ATU/支,标准差为2 226 ATU/支,变异系数为17.5%。在-20℃、4℃和25℃条件下,生物学活性可以稳定保持9个月。结论该批重组水蛭素各项指标均符合要求,性质稳定,可作为国家参考品,用于重组水蛭素的生物学活性检测。