高脂肥胖大鼠肝脏组织中叉头状转录因子O1的表达及其与糖脂代谢的关系

目的:观察高脂肥胖大鼠肝脏组织中叉头状因子O1(FoxO1)的表达,探讨其与血糖、血脂代谢的关系。方法:雄性SD大鼠30只,随机分为对照组(10只,给予常规饲料)和高脂组(20只,给予高脂饲料),共饲养10周。饲养期末取符合肥胖标准的16只大鼠定为肥胖组。检测2组大鼠空腹血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇指数(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用稳态模型指数(HO-MA-IR)评价胰岛素抵抗程度;实时荧光定量RT-PCR检测2组大鼠肝脏FoxO1mRNA的表达。结果:饲养10周后,肥胖组大鼠FBG、Ins、TG、TC、LDL-C和HOMA-IR水平均较对照组升高(t分别为1.952、25.566、8.642、5.845、9.922和23.234,P均<0.05)。与对照组的(19.3±5.1)相比,肥胖组大鼠肝脏FoxO1mRNA表达量(35.6±4.4)增加(t=8.649,P<0.001)。肥胖组大鼠肝脏FoxO1mRNA表达与FBG(r=0.565,P=0.004)、Ins(r=0.564,P=0.004)、TG(r=0.626,P=0.001)和HOMA-IR(r=0.578,P=0.003)呈正相关。结论:高脂肥胖大鼠肝脏组织中FoxO1的表达量升高,且其与血糖、血脂代谢有关,可能参与肥胖和胰岛素抵抗的发病。

叉头状转录因子O1基因过表达慢病毒载体构建及其大鼠系膜细胞株的建立

目的构建含组成性激活突变型Fox O(CA-Fox O1 1)基因的过表达慢病毒载体,并建立其过表达的大鼠肾小球系膜细胞株。方法通过四质粒合成法构建包含CA-Fox O1编码序列的过表达慢病毒载体(LV-CA-Fox O1)。实验分为3组:空白对照组(NC组)、空慢病毒载体阴性对照组(LV-empty-Fox O1组)和过表达慢病毒载体组(LV-CA-Fox O1组)。培养系膜细胞(RMCs)72 h后,用流式细胞仪检测RMCs中绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,并采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测Fox O1的m RNA及蛋白表达情况。结果成功构建LV-CA-Fox O1,其病毒滴度为1×108TU/ml。LV-empty-Fox O1组和LV-CA-Fox O1组GFP阳性率分别为84.5%和81.4%;与NC组相比,LV-CA-Fox O1组Fox O1的m RNA与蛋白表达量相当于NC组的27.92倍与5.41倍(均P<0.05);而NC组与LV-empty-Fox O1组Fox O1的m RNA及蛋白表达量差异均无统计学意义。结论成功构建了大鼠Fox O1基因的过表达慢病毒载体,并建立了稳定过表达Fox O1的大鼠肾小球系膜细胞株,为进一步研究Fox O1的功能和作用机制奠定了研究基础。

促红细胞生成素通过叉头状转录因子O1-糖原合酶激酶3β信号改善棕榈酸诱导HepG2细胞糖代谢

目的观察促红细胞生成素（EPO）处理对棕榈酸（PA）诱导HepG2细胞糖异生及糖原合成的影响及作用机制。方法250μmol／L的PA作用HepG2细胞24h，分别用5、10U／mlEPO作用24h，另外，EPO处理的HepG2细胞分别加入磷脂酰肌醇3激酶（P13K）特异性抑制剂LY294002或渥曼青霉素（wortmannin）预孵育1h。比色法检测HepG2细胞糖原含量，Western blotting检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、P13K蛋白表达、蛋白激酶B（AKT）、叉头状转录因子01（FOX01）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）表达。多组间比较采用方差分析。结果与PA处理组相比，5U／ml和10U／mlEPO处理组细胞下游分子GSK-3β（分别为1．02±0．03比0．74±0．11、1．06±0．02比0．74±0．11，t=4．236、4．996，均P〈0．05）及FOX01磷酸化水平明显增强（分别为0．99±0．05比0．73±0．09、1．13±0．06比0．73±0．09，t=4．798、6．757，均P〈0．05）。与EPO治疗组比较，加入抑制剂LY294002或wortmannin后，GSK．313（0．68±0．09比1．12±0．14、0．76±0．10比1．12±0．14，t=-4．632、-3．655，均P〈0．05）及FOX01（0．92±0．02比1．15±0．06、0．72±0．07比1．15±0．06，t=-6．532、-7．984，均P〈0．05）磷酸化水平均明显被抑制。结论在PA诱导的HepG2细胞，EPO可能通过P13K／AKT介导的FOX01、GSK-3β通路改善糖代谢。

糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1的表达和作用

目的观察糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1（FoxO1）的表达，探讨其与糖尿病肾病发生、发展的关系。方法8周龄健康雄性sD大鼠30只，链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型，采用随机数字表法分为糖尿病组（13只，普通饲料连续喂养4周）和糖尿病肾病组（13只，普通饲料连续喂养12周）。选取健康同龄大鼠18只作为正常对照组（NC组）。4、12周末检测体质量（BW）、血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24h尿蛋白（UPro／24h）及尿白蛋白定量（UAIb）。处死动物后计算肾重指数（KI）；分光光度计测定大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量和总超氧化物歧化酶（SOD）活性；免疫组化法检测肾小球FoxO1蛋白、胶原Ⅳ及纤连蛋白水平；RT—PCR检测肾皮质Fox01mRNA水平；光镜及电镜下观察肾脏组织形态学变化。组间比较采用独立样本t检验。结果糖尿病肾病组肾皮质MDA蛋白、肾小球胶原Ⅳ和纤连蛋白水平显著高于糖尿病组[分别为（3．49±0．31）VS（2．34±0．28）nmol／mgProt，20．1±1．3VS10．1±1．0，10．6±1．3VS6．3±1．0，t值分别为9．290、20．967、9．119，均P〈0．05]；糖尿病肾病组肾皮质SOD活性蛋白、Fox01mRNA表达水平明显低于糖尿病组[分别为（23±8）VS（43±6）U／mgProt，0．20±0．06VS0．35±0．05，t值分别为7．069、6．717，均P〈0．05]。FoxO1蛋白表达水平各组问比较无显著差异（均P〉0．05）。结论糖尿病肾病大鼠肾皮质FoxO1 mRNA表达水平降低，其机制可能通过下调其抗氧化靶基因使。肾脏氧化应激反应增强，从而参与糖尿病肾病发生发展的过程。

叉头状转录因子O1对糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和desmin表达的影响

旨在探讨叉头状转录因子O1（FoxO1）对糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和结蛋白（desmin）表达的影响。建立糖尿病大鼠模型，随机分为糖尿病＋空慢病毒载体（LV-pSC-GFP）感染组（LV-NC组）、糖尿病＋大鼠结构性活性FoxO1慢病毒载体（LV-FoxO1-AAA）感染组（LV-CA组）、糖尿病组（DM组），另设对照组。于慢病毒感染后的2、4、8周末，测大鼠尿白蛋白、体重、血糖、血肌酐、尿素氮，光镜和透射电镜下观察肾小球及其足细胞结构变化，实时定量PCR和Western印迹法检测大鼠肾皮质中FoxO1、Ⅳ型胶原α3链（COL4A3）、Ⅳ型胶原α5链（COL4A5）、desmin mRNA和蛋白的表达。与LV-NC、DM组相比，LV-CA组大鼠肾脏FoxO1 mRNA、蛋白表达水平明显升高（P〈0.05），尿白蛋白、血肌酐、尿素氮明显降低（2周除外）（P〈0.05），肾脏中COL4A3、COL4A5、desmin mRNA和蛋白水平也明显降低（P〈0.05），肾脏病理学变化有明显改善。通过靶向注射慢病毒载体来上调FoxO1的表达可改善糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和desmin的异常表达。

叉头状转录因子O1对肥胖者内脏脂肪组织葡萄糖转运体4 mRNA及蛋白表达的影响

目的 利用RNAi技术沉默肥胖者内脏脂肪组织中叉头状转录因子O1(FOXO1)基因后检测葡萄糖转运体4(GLUT4)的mRNA和蛋白表达,探讨肥胖者FOXO1与胰岛素抵抗的关系及机制.方法 构建转录因子FOXO1特异性siRNA载体pSIREN-DNR-DsRed-siFOXO1(FOXO1-siRNA)质粒并鉴定;选取5例肥胖者大网膜脂肪组织利用脂质体为媒介转染FOXO1-siRNA质粒;半定量RT-PCR检测FOXO1 mRNA表达,测定抑制效率;半定量RT-PCR检测GLUT4 mRNA表达量,Westernblot检测GLUT4蛋白表达量.采用t检验进行统计分析.结果 成功构建FOXO1-siRNA质粒,转染此质粒的脂肪组织细胞FOXO1 mRNA表达水平与对照组相比下降约49%(P＜0.05),说明转染成功;FOXO1-siRNA质粒转染组GLUT4 mRNA较对照组增加约1.33倍(P=0.001),FOXO1-siRNA质粒转染组GLUT4蛋白较对照组增加约1.25倍(P＜0.05).结论 抑制肥胖者网膜内脏脂肪组织FOXO1基因的表达可引起GLUT4 mRNA及蛋白表达增加.

叉头状转录因子O1对糖尿病大鼠足细胞影响的实验研究

目的 探讨叉头状转录因子O1（Fox01）对糖尿病大鼠足细胞的影响.方法 链脲佐菌素（STZ）诱导构建糖尿病大鼠模型90只,并采用简单随机抽样法分为糖尿病（DM）＋空慢病毒载体（LV-pSC-GFP）感染组（LV-NC组,n=30）,DM＋大鼠结构性活性FoxO1慢病毒载体（LV-CA-FoxO1）感染组（LV-CA组,n=30）,DM组（n=30）,另设对照组（NG组,n=30）注射相应体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液.于慢病毒感染后的2、4、8周末,测大鼠尿白蛋白、体重、血糖、血肌酐、尿素氮,光镜和透射电镜观察肾小球及其足细胞结构变化,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting法检测大鼠肾皮质中FoxO1、足盂蛋白（PCX）、nephrin mRNA和蛋白的表达.多组间比较采用单因素方差分析.结果 与LV-NC、DM组相比,LV-CA组大鼠肾脏中FoxO1 mRNA、蛋白表达水平明显升高（F8W值分别为10 919.75、3 867.34,均P＜0.05）,尿白蛋白、血肌酐、尿素氮明显降低（2周除外）（F8W值分别为132.72、187.68、503.69,均P＜0.05）,肾脏中PCX、nephrin mRNA和蛋白水平明显升高（mRNA F8w值分别为778.94、478.10;蛋白F8W值分别为393.64、255.79,均P＜0.05）,肾脏病理学变化也明显改善,可见肾小球体积减小,系膜细胞及基底膜增生程度降低,足突融合也有一定程度改善.结论 通过靶向注射慢病毒载体来上调FoxO1的表达可改善DM大鼠足细胞的损伤.

过表达叉头状转录因子O1对高糖下足细胞氧化应激的影响及机制

目的研究过表达叉头状转录因子O1（FoxO1）对高糖条件下小鼠足细胞及线粒体功能的影响及机制。方法分别采用过表达FoxO1的慢病毒（LV-CA-FoxO1）和空病毒（LV-NC）感染条件永生性小鼠肾足细胞，在不同糖浓度（正常糖5.5 mmol/L、高糖25.0 mmol/L）下培养72 h。实验分为正常糖组、高糖组、FoxO1组（高糖＋LV-CA-FoxO1）和NC组（高糖＋LV-NC）共4组，分别检测各组细胞FoxO1表达情况、线粒体及细胞功能指标。多组间比较采用方差分析，组内比较采用SNK法。结果（1）与高糖组比较，FoxO1组FoxO1转录活性增加[（0.94±0.06）比（2.72±0.27），q=3.77，P〈0.05]；活性氧簇和丙二醛量减少（q=9.22、2.44，均P〈0.05），线粒体膜电位上升，线粒体结构损伤减轻；（2）FoxO1组较高糖组足细胞蛋白nephrin、podocin和podocalyxin表达增加（q=2.18、5.87、5.65，均P〈0.05），单层屏障功能改善，凋亡率下降（q=6.96、8.99，均P〈0.05）；（3）FoxO1组较高糖组中PTEN诱导激酶1（PINK1）、parkin mRNA水平上升，线粒体动力相关蛋白1 mRNA下降（q=1.46、7.50、1.89，均P〈0.05）。与高糖组比较，FoxO1组PINK1蛋白表达水平上升（q=2.36，P〈0.05）。NC组与高糖组各项指标比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论过表达FoxO1可减轻高糖诱导的小鼠足细胞线粒体及细胞功能损伤，可能通过激活PINK1/parkin途径实现。

电针对高脂饮食诱导的肥胖大鼠下丘脑沉默信息调节因子1、叉头状转录因子O1及阿黑皮素原的影响

目的:观察电针对高脂饮食诱导的肥胖(DIO)大鼠下丘脑沉默信息调节因子1(SIRT1)、叉头状转录因子O1(FoxO1)及阿黑皮素原(POMC)的影响,探讨电针调节中枢食欲肽减肥的作用机制。方法:雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、电针+抑制剂组(针+抑组)、抑制剂组、假手术组,每组10只。采用高脂饮食喂养诱导DIO大鼠模型。电针组和针+抑组电针"丰隆""中脘""关元""足三里"穴,10min/次;针+抑组和抑制剂组予以第三脑室置管并注射SIRT1特异性拮抗剂EX-527;假手术组予以第三脑室内置管,并注射人工脑脊液;均每周治疗3次,共治疗8周。观察各组大鼠治疗前后体质量、进食量、Lee’s指数,全自动生化分析仪检测大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)含量,Western blot法检测大鼠下丘脑组织SIRT1、FoxO1、乙酰化FoxO1(AC-FoxO1)、POMC蛋白的表达水平。结果:治疗前,与正常组比较,模型组、电针组、针+抑组、抑制剂组、假手术组的体质量、进食量均明显升高(P<0.01),模型组和假手术组Lee’s指数增高(P<0.05)。治疗后,与模型组比较,电针组、针+抑组大鼠体质量、进食量、TC含量、AC-FoxO1表达量均显著降低(P<0.01,P<0.05),SIRT1、FoxO1和POMC表达量均明显升高(P<0.01,P<0.05);电针组Lee’s指数及血清TG、FFA含量显著降低(P<0.05,P<0.01);抑制剂组进食量,血清TC、TG、FFA含量显著升高(P<0.01),SIRT1、FoxO1、POMC表达量显著降低(P<0.01,P<0.05)。与电针组比较,针+抑组与抑制剂组的体质量、进食量、Lee’s指数及TG、FFA含量,AC-FoxO1表达量均明显升高(P<0.01,P<0.05),SIRT1、FoxO1和POMC表达量均显著降低(P<0.01);抑制剂组血清TC含量显著升高(P<0.01)。与针+抑组比较,抑制剂组体质量、进食量及TC、TG、FFA含量,AC-FoxO1表达量显著增高(P<0.01),SIRT1、FoxO1和POMC表达量明显降低(P<0.01)。结论:电针能有效上调DIO大鼠下丘脑中SIRT1的表达,从而去乙酰化作用于FoxO1,并促进下游抑食欲肽POMC的表达,可能是电针减肥的效应机制之一。

虎杖苷促进大鼠骨质疏松性骨折的作用及对SIRT1/FoxO1信号通路的影响

目的探究虎杖苷对骨质疏松性骨折大鼠骨折愈合的效果及对沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头状转录因子O1(FoxO1)信号通路的影响。方法构建骨质疏松性骨折大鼠模型,将建模成功的48只大鼠随机分为模型组、虎杖苷低剂量(30 mg/kg)组、虎杖苷高剂量(60 mg/kg)组、阿仑膦酸钠组(0.5 mg/kg)。另取12只大鼠作为对照组,构建相同部位骨折模型。建模结束后,各组大鼠给予相应药物灌胃,每天1次,连续8周。对大鼠进行骨折愈合程度评分并检测骨折处骨密度(bone mineral density,BMD);运用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中I型胶原交联羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨钙素(OC)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;通过苏木素-伊红染色观察大鼠骨组织病理学;通过荧光定量PCR法检测大鼠骨组织中SIRT1、FoxO1信使RNA(mRNA)水平;通过蛋白印迹法检测大鼠骨组织中SIRT1、FoxO1蛋白水平。结果与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠骨组织病理学变化程度依次减轻,骨折愈合程度评分、骨折处BMD、血清中OC、骨组织中SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白水平依次升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平依次降低(P<0.05);阿仑膦酸钠组和虎杖苷高剂量组大鼠骨组织病理学变化及各项指标比较均无显著差异(P>0.05)。结论虎杖苷可减轻骨质疏松性骨折大鼠炎症反应,提升BMD,促进骨折愈合,其机制可能与激活SIRT1/FoxO1信号通路有关。

干扰FoxO1慢病毒包装及稳转大鼠骨髓间充质干细胞株的建立

目的建立干扰叉头状转录因子O1(FoxO1)的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)稳转株,为研究BMSCs定向分化提供条件。方法提取大鼠原代BMSCs。构建FoxO1干扰载体,扩增后进行测序鉴定。FoxO1质粒瞬转293T细胞后,通过Western blot验证其干扰效果,并选择干扰效果最好的质粒载体。然后通过三因子慢病毒包装系统将FoxO1质粒和两个辅助质粒共转染293T细胞,包装慢病毒,组名为sh1,sh2,sh3,Vector。包装的干扰慢病毒和阴性对照病毒感染大鼠BMSCs,通过Western blot和RT-qPCR检测其表达效果。结果成功提取大鼠原代BMSCs;测序结果显示,重组FoxO1质粒构建成功;重组FoxO1质粒瞬时转染293T细胞48 h,细胞荧光明显,表明EGFP表达良好;Western blot结果显示,载体中标签蛋白表达成功,并筛选到干扰效果最佳的目的质粒sh1-FoxO1;干扰FoxO1慢病毒滴度为1×10^(8) TU·μL^(-1);包装完成的慢病毒感染BMSCs,经嘌呤霉素筛选后,Western blot结果显示,与Vector组相比,sh1组FoxO1的蛋白相对表达量降低(P<0.05);RT-qPCR结果显示,与Vector组相比,sh1组FoxO1的mRNA相对表达量降低(P<0.01),得到干扰FoxO1的大鼠BMSCs稳转株。结论成功构建了FoxO1干扰BMSCs稳转株,为进一步研究FoxO1在诱导BMSCs定向分化为IPCs过程中的作用及其潜在机制奠定了基础。

黄芪多糖调控Sirt1/FoxO1通路抑制多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬的研究

目的探究黄芪多糖(APS)调控沉默信息调节因子1/叉头状转录因子O1(Sirt1/FoxO1)通路对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠颗粒细胞自噬的影响。方法大鼠中分离卵巢颗粒细胞并经促卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,且CCK8检测APS对卵巢颗粒细胞增殖的影响。10-5mol/L丙酸睾丸酮、10μmol/L C2-神经酰胺作用大鼠卵巢颗粒细胞24 h诱导PCOS大鼠颗粒细胞自噬模型,CCK8检测细胞增殖情况;透射电镜观察自噬体情况;免疫印迹法检测细胞中Sirt1、Fox O1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达情况。结果免疫荧光检测显示,FSHR蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的平均阳性表达量93.18%>90%,可进行接下来实验。0、100、200、400μg/mL APS处理正常卵巢颗粒细胞,在贴壁0、24 h比较,细胞OD450差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,模型组细胞核附近出现大量自噬小体,双层、单层膜包裹胞质形成封闭、圆形结构,部分自噬小体内膜溶解,自噬小体周围可见单层膜结构包裹着一些被降解的胞浆、类似自噬小体结构;100μg/mL APS组与模型组细胞结构类似,随着APS剂量的升高,自噬小体数量减少,在400μg/m L APS组时细胞正常。正常组、模型组、100、200、400μg/mL APS组在细胞贴壁0 h时,细胞OD450差异无统计学意义(P>0.05)。细胞贴壁24 h,与正常组相比,模型组细胞OD450降低(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,100、200、400μg/mL APS组细胞OD450升高(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(P<0.05)。结论APS可以抑制PCOS大鼠颗粒细胞自噬,可能是通过抑制自噬通路Sirt1/FoxO1实现的。

人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1 mRNA和蛋白表达水平及其意义

目的:探讨人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型(HepG2/IR)和逆转模型(HepG2/IRPH)中叉头状转录因子O1(FoxO1)的mRNA和蛋白表达水平,阐明该基因参与IR的作用机制。方法:选择人源肝癌HepG2细胞,采用终浓度1×10^(-10)、1×10^(-9)、1×10^(-8)、1×10^(-7)、1×10^(-6)和1×10^(-5) mol·L^(-1)胰岛素诱导24、48和72h,对照组细胞不加胰岛素,用葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖水平,计算各组细胞的葡萄糖消耗量,以确定IR模型建立的最佳诱导条件;采用终浓度为0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000mmol·L^(-1)盐酸吡咯列酮(PH)诱导HepG2建立逆转抵抗模型,同时设立对照组,MTT法检测细胞增殖活性,确定PH的最佳逆转浓度;利用Real-time PCR法和Western blotting法检测各组细胞FoxO1mRNA和蛋白表达水平。结果:1×10-7 mol·L^(-1)胰岛素作用36h,葡萄糖消耗量减少45.84%,发生明显的IR,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,1.25mmol·L^(-1)PH逆转抵抗24h,细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)。人源肝癌HepG2细胞发生IR时,与对照组比较,FoxO1mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01);IR模型逆转后,与对照组比较,FoxO1mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人源肝癌HepG2细胞IR与FoxO1mRNA的表达有关联性,FoxO1mRNA表达水平检测有可能作为胰岛素增敏剂的药效评估指标,降低FoxO1mRNA表达水平可作为2型糖尿病治疗的新靶点。

血清同型半胱氨酸水平与外周血中FOXO1DNA甲基化在糖尿病视网膜病变中的关联性研究

目的研究糖尿病视网膜病变(DR)患者血清中同型半胱氨酸(Hcy)和外周血中叉头状转录因子O1(FOXO1)DNA甲基化水平,为深入探讨DR的发生机制和靶向性治疗提供实验依据。方法收集2013年1月-2016年3月宁夏银川市第一人民医院眼科和内分泌科门诊及住院的2型糖尿病(DM)患者资料,根据是否伴有视网膜病变分为2组:无视网膜并发症患者作为DM组,DR患者为DR组,检测患者血清中Hcy水平、糖化血红蛋白含量、外周血中FOXO1 m RNA表达水平,并采用甲基化特异性PCR技术分析FOXO1 DNA甲基化水平,分析Hcy与FOXO1 DNA甲基化的相关性。结果一般资料分析可见DR组患者病程较长,血清Hcy水平显著升高。与DM组相比,在DR组中FOXO1 m RNA表达升高了3.25倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。DR患者外周血中FOXO1 DNA甲基化水平显著下降,与DM组相比下降了51.23%,差异具有统计学意义(P<0.01)。Hcy与FOXO1 DNA甲基化水平呈负相关(r2=-0.4833,P=0.0016)。结论 Hcy可能通过下调FOXO1 DNA甲基化水平上调了FOXO1的表达而参与DR的发生发展,可能成为靶向性治疗DR的潜在靶点。

FOXO1表达改变在糖尿病视网膜病变中的关联性研究

目的研究糖尿病视网膜病变(DR)患者FOXO1基因表达改变,进一步了解DR的发病机制,为DR的治疗提供新的基因靶点和依据。方法收集眼科、内分泌科住院部及门诊糖尿病(DM)患者的临床资料,分为DR组110例,糖尿病正常眼底组(NDR)120例。以荧光定量PCR方法检测FOXO1 mRNA表达水平,用Western blot检测FOXO1蛋白表达水平。结果 DR组与NDR组相比,FOXO1 mRNA表达在DR组中显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);DR组中FOXO1蛋白表达水平水平相比较NDR组明显增高(P<0.05)。结论 FOXO1在DR中的表达明显改变,这可能为DR提供潜在的治疗靶点。

siRNA沉默FoxO1对STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜IL-1β的影响及其作用机制

目的:探讨抑制叉头状转录因子O1(FoxO1)表达对糖尿病大鼠视网膜IL^(-1)β的影响及其作用机制。方法:将人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)用不同浓度葡萄糖处理后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞FoxO1、IL^(-1)β表达。HRCECs按照处理方式分为空白对照组(Mock组)、阴性对照组(NC-FoxO1组)和siFoxO1组(si-FoxO1组),RT-PCR检测各组细胞FoxO1、IL^(-1)βmRNA表达,Western blot检测各组细胞FoxO1、IL^(-1)β、p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达。60只大鼠随机分为对照组(Control组)、DM组、si-FoxO1转染组(LV-si-FoxO1组)和空病毒转染组(LV-NC组),DM组、LV-si-FoxO1组、LV-NC组建立糖尿病大鼠模型,造模成功后向大鼠玻璃体腔注射LV-si-FoxO1或LV-NC慢病毒载体,注射12周后分离视网膜组织,分别采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blot检测大鼠视网膜组织FoxO1、IL^(-1)β表达。结果:与5 mmol·L^(-1)葡萄糖浓度组比较,15 mmol·L^(-1)浓度组FoxO1、IL^(-1)βmRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),25 mmol·L^(-1)浓度组FoxO1、IL^(-1)βmRNA和蛋白表达明显高于5 mmol·L^(-1)浓度组,而35 mmol·L^(-1)浓度组FoxO1、IL^(-1)βmRNA和蛋白表达增加的更明显,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。si-FoxO1组IL^(-1)βmRNA和蛋白表达明显低于NC-FoxO1组和Mock组(P<0.05),NC-FoxO1组和Mock组IL^(-1)βmRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。DM组和LV-NC组FoxO1、IL^(-1)βmRNA和蛋白表达明显高于Control组和LV-si-FoxO1组(P<0.05),LV-NC组与Control组FoxO1、IL^(-1)β表达差异无统计学意义(P>0.05),DM组和LV-NC组FoxO1、IL^(-1)β表达差异无统计学意义(P>0.05)。si-FoxO1组p-P38、p-JNK、pERK蛋白表达明显低于NC-FoxO1组和Mock组(P<0.05),NC-FoxO1组和Mock组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:高糖能够诱导HRCECs FoxO1、IL^(-1)β表达增加,抑制FoxO1表达可能是通过降低MAPK磷酸化下调HRCECs细胞IL^(-1)β表达实现的。

抑制miR-101对糖尿病肾病模型大鼠肾组织中FOXO1蛋白和自噬水平的影响

目的 探究抑制微小RNA(miR)-101对糖尿病肾病(DN)模型大鼠的影响以及对肾组织叉头状转录因子O1(FoxO1)和自噬的影响。方法 通过腹腔注射链脲佐菌素建立DN模型,随机选择30只DN大鼠分为DN组(n=15)和DN+miR-101 antagomir组(n=15),15只健康大鼠作为对照组。尾静脉注射miR-101 antagomir(300μg)以抑制miR-101的水平。通过HE染色验证建模结果和抑制miR-101对肾组织的保护作用。检测和比较各组的肾功能指标、miR-101、FoxO1 mRNA和蛋白、自噬蛋白(Beclin1和LC3Ⅱ)表达量。结果 建模后和干预后,DN组和DN+miR-101 antagomir组的血糖水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),且均显著高于对照组(均P<0.05)。三组大鼠的上述各项指标比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。DN组的24 h尿蛋白、肌酐和miR-101水平显著高于对照组,FoxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表达量显著低于对照组(均P<0.05)。DN+miR-101 antagomir组的24 h尿蛋白、肌酐和miR-101水平显著低于DN组,FoxO1的mRNA和蛋白、Beclin1和LC3Ⅱ表达量显著高于DN组(均P<0.05)。结论 抑制miR-101可以缓解DN大鼠肾组织损伤保护肾功能,并提高FoxO1蛋白表达量,促进细胞自噬。

电针通过SIRT1-FOXO1通路激活自噬减轻神经病理性疼痛的机制

目的探讨电针通过沉默信息调节因子(SIRT1)1-叉头状转录因子(FOX)O1通路激活自噬减轻神经病理性疼痛(NP)的机制。方法实验分为假手术组、模型组、电针组、电针+抑制剂组,每组12只。除假手术组外,其余各组建立坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)所致NP大鼠模型,造模第7天电针组选用“环跳”“阳陵泉”穴电针针刺;电针+抑制剂组在电针组基础上分别在第7天、第10天、第14天脊髓鞘内注射SIRT1抑制剂EX-527;假手术组和模型组鞘内注射等体积二甲基亚砜(DMSO)。造模前、造模后给药前、给药后测定机械缩足反射阈值(MWT)和热刺激缩足反射潜伏期(PWTL);免疫荧光检测脊髓SIRT1蛋白表达情况;透射电镜下观察脊髓超微结构;Western印迹检测脊髓中微管相关蛋白1轻链(LC)3、SIRT1、FOXO1蛋白水平。结果造模前,各组MWT、PWTL差异无统计学意义(P>0.05)。造模后给药前,与假手术组相比,模型组、电针组、电针+抑制剂组MWT、PWTL明显降低(P<0.05)。给药后,模型组出现线粒体肿胀破裂现象,且与溶酶体融合,未发现明显的自噬小体;电针组线粒体结构基本恢复,自噬小体数量多,双膜包裹里可见少量的内质网碎片;电针+抑制剂组自噬小体数量较电针组明显减少,自噬小体部分出现单膜结构。与假手术组相比,模型组MWT、PWTL、脊髓中SIRT1蛋白免疫荧光强度和蛋白水平、FOXO1、LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低(P<0.05),LC3Ⅰ蛋白水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,电针组MWT、PWTL、脊髓中SIRT1蛋白免疫荧光强度和蛋白水平、FOXO1、LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显升高(P<0.05),LC3Ⅰ蛋白水平明显降低(P<0.05);与电针组相比,电针+抑制剂组MWT、PWTL、脊髓中SIRT1蛋白免疫荧光强度和蛋白水平、FOXO1、LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低(P<0.05),LC3Ⅰ蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论电针通过激活SIRT1-FOXO1通路激活自噬减轻NP,实现对NP大鼠的保护。

骨钙素对小鼠3T3-L1细胞分化的影响及与irt2/FoxO1关系的研究

目的:观察骨钙素对小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及对Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的影响,探讨骨钙素通过Sirt2/FoxO1通路控制肥胖、改善胰岛素抵抗、遏制2型糖尿病的机制。方法:将细胞接种到培养板中,加入诱导分化剂诱导其分化。用ELISA法检测各组中Sirt2、FoxO1以筛选最佳骨钙素剂量;油红O染色,观察细胞形态及脂肪含量变化,分光光度计510 nm波长处测量OD值。Real-Time PCR法检测各组中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的表达。结果:骨钙素与Sirt2及FoxO1呈正相关(P<0.05)。A组细胞中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的mRNA表达量均较B组升高(P<0.05)。C组细胞中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的mRNA表达量较A组降低(P<0.05)。B、C组OD值明显高于A组(P<0.05)。结论:骨钙素可能通过Sirt2/FoxO1通路发挥作用调节脂联素及GLUT4的表达从而控制肥胖、改善胰岛素抵抗、可能有遏制2型糖尿病发生发展的作用。

基于Sirt1/FoxO1通路探讨体外冲击波联合富血小板血浆治疗膝关节骨性关节炎大鼠软骨损伤的作用机制

目的基于沉默信息调节因子1/叉头状转录因子O1(Sirt1/FoxO1)通路探讨体外冲击波联合富血小板血浆治疗膝关节骨性关节炎(KOA)大鼠关节软骨损伤的作用机制。方法15只SD大鼠用于富血小板血浆提取,剩余35只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、体外冲击波组、富血小板血浆组及体外冲击波+富血小板血浆组,每组各7例。干预完成后,关节软骨组织苏木精-伊红(HE)染色观察关节软骨形态变化,Mankin评分进行病理评估,细胞活力检测(CCK-8)法检测关节软骨细胞活力和增殖情况,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测关节液中炎症因子水平,蛋白质印迹法检测各组关节软骨组织Sirt1、acely-FoxO1/FoxO1表达水平。结果关节软骨组织HE染色显示,模型组、体外冲击波组、富血小板血浆组及体外冲击波+富血小板血浆组均存在不同程度的病理损伤,其中模型组最为严重,其他3组差异不大。Mankin评分和关节软骨组织acely-FoxO1/FoxO1水平比较,空白对照组<体外冲击波+富血小板血浆组<富血小板血浆组<体外冲击波组<模型组(均P<0.05)。关节软骨组织Sirt1水平、关节软骨细胞活力和增殖能力比较,模型组<体外冲击波组<富血小板血浆组<体外冲击波+富血小板血浆组<空白对照组(均P<0.05);关节液中炎症因子水平比较,空白对照组<体外冲击波+富血小板血浆组<体外冲击波组<富血小板血浆组<模型组(均P<0.05)。结论体外冲击波联合富血小板血浆可通过上调Sirt1表达和下调FoxO1乙酰化水平,促进骨关节炎软骨细胞增殖,减轻KOA大鼠关节炎症反应和关节软骨损伤。