miR-4539通过靶向作用于叉头盒转录因子1抑制胶质瘤细胞生长的实验研究

目的 探讨miR-4539抑制胶质瘤细胞生长的效应及相关机制。方法 采用RT-PCR法检测脑胶质瘤标本和7株胶质瘤细胞株中miR-4539的表达水平。采用CCK-8法、流式细胞法、Western blot法检测miR-4539在胶质瘤细胞中的作用。采用双荧光素酶实验验证叉头盒转录因子1(Foxp1)是否是miR-4539的直接靶点。构建小鼠移植瘤模型,探讨miR-4539转染对小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果 (1)miR-4539在胶质瘤组织中的表达水平显著低于正常脑组织(P<0.05)。miR-4539在7个常用的人脑胶质瘤细胞系(U87、U251、U373、T98G、LN18、LN229、SF295)中的表达量显著低于人正常脑胶质细胞株HEB(P<0.05)。(2)与miR-NC组相比,miR-4539转染72 h后,T98G细胞和LN18细胞中miR-4539的表达水平都显著增加(P<0.05)。CCK-8检测显示,外源性miR-4539过表达可显著抑制T98G和LN18细胞的增殖。同时可诱导T98G和LN18细胞周期阻滞,G0/G1期细胞百分率增加,S期细胞百分率降低,且细胞周期调控蛋白cyclinD1、cyclinE1和Ser780的表达水平也显著降低(P<0.05)。(3)荧光素酶报告显示,Foxp1是miR-4539的直接靶点,可被miR-4539直接调控。接种T98G细胞后6周,miR-4539转染组小鼠移植瘤平均体积、平均重量均显著小于miR-NC组(P<0.05)。(4)T98G和LN18细胞过表达miR-4539后,Foxp1mRNA和蛋白表达都显著降低,免疫荧光结果也确认,miR-4539降低了Foxp1在T98G细胞和LN18细胞中的表达。结论 miR-4539可通过靶向作用于Foxp1发挥抑癌因子效应,有望成为脑胶质瘤患者诊断和治疗的新靶点。

叉头盒转录因子O1基因多态性与中国重庆汉族人2型糖尿病相关性研究

目的 探讨叉头盒转录因子O1（FOXO1）基因单核苷酸多态性（SNPs）与中国重庆汉族人2型糖尿病（T2DM）的相关性.方法 （1）在无血缘关系的105名中国重庆汉族人中,采用PCR-RFLP和基因测序法,对FOXO1基因编码区和非编码区的15个SNPs进行筛查,连锁不平衡（LD）分析,构建单倍型.（2）选择重庆地区704名汉族人（414名T2DM患者,290名健康人）进行病例对照研究,对位于同一单倍域的5个SNPs进行基因型鉴定,分析SNPs及单倍型与T2DM的关联.结果 （1）共筛查到12个SNPs;外显子Thr488Asn在该人群中未发现多态现象.LD分析提示rs17592236、rs9577066、rs7986407、rs4581585和rs4325426位于同一单倍域内（D＇＞0.7）.（2）rs7986407、rs4581585与T2DM发病相关：rs7986407位点AA基因型个体T2DM患病风险是GG基因型的1.42倍（additive模式OR=1.420,95％CI：0.783～2.577,P=0.011）;rs4581585位点CC基因型个体T2DM患病风险是TT基因型的2.57倍（additive模式OR=2.571,95％CI：1.404～4.695,P=0.002）.年龄、体质量指数、血糖、血脂、胰岛素、Homa-IR和Homa-β等在不同基因型间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 FOXO1基因可能是中国重庆汉族人T2DM的易感基因.

机械性创伤致继发性肺损伤大鼠肺组织中叉头盒转录因子A1表达的变化及意义

目的 研究机械性创伤致继发性肺损伤大鼠肺组织中叉头盒转录因子（Fox）A1表达的变化及意义。方法将雄性Wistar大鼠40只完全随机分为伪创伤组和创伤组，每组20只。利用Noble-Collip创伤仪制备机械性创伤模型。全部大鼠均于造模后6h腹主动脉采血处死，提取肺组织的总RNA和总蛋白。逆转录聚合酶链反应检测FoxAlmRNA的表达，蛋白质印迹检测FoxAl蛋白的表达。结果创伤组FoxAlmRNA表达水平高于伪创伤组（P〈0．01），是伪创伤组的9．25倍；FoxAl蛋白表达：伪创伤组（0．59±0．04），创伤组（0．91±0．03），创伤组FoxAl蛋白表达水平高于伪创伤组，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论FoxAl在机械性创伤致继发性肺损伤中起着重要的作用。

叉头盒转录因子M1调控葡萄糖转运蛋白1影响胃癌细胞的糖代谢及生物学特性

目的观察叉头盒转录因子M1（FOXM1）通过调控葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达对胃癌细胞的糖代谢、细胞增殖和凋亡的影响。方法Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测胃癌细胞（AGS、SGC-7901）和正常胃黏膜细胞（GES-1）3株细胞中FoxM1、GLUT1的蛋白及mRNA的表达。转染FoxM1过表达载体和小干扰RNA（siRNA）感染序列至胃癌细胞，检测FoxM1和GLUT1表达及细胞对葡萄糖的摄取变化。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖活力，流式细胞凋亡检测分析细胞凋亡，并与阴性转染细胞比较。结果AGS、SGC-7901细胞中FoxM1 mRNA的相对表达量为2.624±0.167、3.023±0.159（t=16.686，P=0.004；t=21.810，P=0.002），GLUT1 mRNA的相对表达量为3.582±0.237、3.867±0.285（t=18.700，P=0.003；t=17.315，P=0.003），均明显高于正常胃黏膜细胞。FoxM1蛋白在AGS、SGC-7901的表达量2.852±0.271、2.533±0.243（t=11.814，P=0.007；t=10.900，P=0.008）较GES-1中1.000±0.017明显升高。GLUT1蛋白在AGS、SGC-7901的表达量3.716±0.316、3.367±0.335较GES-1中1.000±0.021明显升高（t=14.854，P=0.005；t=12.214，P=0.007）。转染FoxM1过表达载体后AGS、SGC-7901两组胃癌细胞中GLUT1的表达明显升高，糖摄取量增加（t=3.242，P=0.048；t=3.964，P=0.029）。AGS转染后48 h和72 h促进细胞增殖（t=10.062，P=0.002；t=6.466，P=0.008），抑制细胞凋亡[（1.36±0.29）%比（3.16±0.32）%，t=－7.219，P=0.006]。转染FoxM1 siRNA感染序列后两组胃癌细胞中GLUT1的表达明显降低，糖摄取量减少（t=－4.217，P=0.024；t=－3.879，P=0.030）。AGS转染后48 h和72 h抑制细胞增殖（t=－10.280，P=0.002；t=－12.530，P=0.001），促进细胞凋亡[（8.02±0.69）%比（3.03±0.26）%，t=11.722，P=0.007]。结论FoxM1调控GLUT1表达促进胃癌细胞葡萄糖摄取和细胞增殖，抑制细胞凋亡。

沉默信息调节因子1和叉头盒转录因子M1在病理性瘢痕组织中的表达及意义

目的 观察沉默信息调节因子1（SIRTl）和叉头盒转录因子M1（FOXMl）在病理性瘢痕中的表达及其相互关系,探讨它们在瘢痕形成中的作用及机制.方法 利用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法、Western blot检测正常皮肤（10例）、成熟瘢痕（10例）、病理性瘢痕（10例）组织中SIRT1和FOXM1的mRNA、蛋白表达水平并进行统计学分析.结果 正常皮肤、成熟瘢痕、病理性瘢痕组织中SIRT1的mRNA及蛋白相对表达水平分别为1.0、1.187982±0.082916、2.402 178±0.178 598;0.498 614±0.056 342、0.534 159±0.044 509、0.976 829±0.145 736.FOXM1的mRNA及蛋白相对表达水平分别为1.0、1.196 429±0.086 786、2.447 249±0.128 875;0.469 935±0.089 373、0.552 653±0.078 293、0.915 367±0.114097.病理性瘢痕组织中SIRT1与FOXM1的mRNA相对表达水平均显著高于正常皮肤、成熟瘢痕（P＜0.01）;病理性瘢痕组织中SIRT1与FOXM1的蛋白相对表达水平均明显增高,与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 SIRT1和FOXM1在病理性瘢痕组织中表达增高,通过调节这两个因子的表达,可能促进瘢痕组织中细胞的增生,对病理性瘢痕的形成可能起重要作用.

叉头盒家族转录因子o1抑制剂重塑七氟醚对糖尿病小鼠肾脏缺血再灌注保护效应的影响研究

目的观察七氟醚对糖尿病肾脏缺血再灌注损伤的影响,探讨叉头盒家族转录因子o1(Foxo1)的靶向抑制剂AS1842856对七氟醚糖尿病肾脏缺血再灌注保护效应的影响。方法40只C57雄性小鼠随机分为糖尿病假手术组(S组)、糖尿病肾脏缺血再灌注组(I组)、糖尿病肾脏缺血再灌注七氟醚处理组(I+S组)和糖尿病肾脏缺血再灌注AS1842856处理组(I+S+AS组),每组各10只。收集各组体重、饮食、饮水、血糖、血肌酐(Scr)及BUN水平;PAS染色评价损伤情况;Western blot法及qRT-PCR法检测各组肾组织中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Foxo1、p-Foxo1、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白、mRNA水平、Foxo1下游凋亡基因BCL2-Associated X的促凋亡蛋白(Bim)、Fas、糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、胰岛素转录因子肌腱膜纤维肉瘤爱吸引同系物A(MaFA)、神经源性分化因子1(NeuroD1)和胰十二指肠同源异形盒1(Pdx1)的mRNA水平。结果与I组比较,I+S+AS组Scr、BUN水平降低(P<0.05);p-Akt及p-Foxo1蛋白表达升高(P<0.05),Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);Caspase-3及Foxo1下游调控因子Bim、Fas、G6Pase、PEPCK、MafA、NeuroD1的mRNA表达降低(P<0.05),Akt、Pdx1的mRNA表达升高(P<0.05)。结论肾脏缺血再灌注合并糖尿病时,七氟醚预处理肾脏缺血再灌注保护效应消失,Foxo1靶向抑制剂AS1842856可重塑七氟醚糖尿病肾脏缺血再灌注保护效应。

miR-199a在妊娠糖尿病中的表达及参与胰岛素抵抗的作用机制研究

目的探究微小RNA(miR)-199a在妊娠糖尿病(GDM)中的表达及调控沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头盒转录因子O1(FOXO1)通路参与胰岛素抵抗(IR)的机制。方法GDM孕妇56例为GDM组,正常孕妇60例为正常孕妇组,实时荧光定量PCR(qPCR)检测2组胎盘中miR-199a水平;计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);Pearson相关分析miR-199a与HOMA-IR的相关性。体外培养人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo并建立IR模型。miR-199a功能验证:细胞依处理方式不同分为模型组、miRNA inhibitor NC组、miR-199a inhibitor组、miRNA mimic NC组、miR-199a mimic组;qPCR检测各组细胞中miR-199a表达情况,蒽酮法检测细胞内葡萄糖吸收量,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,Western blot检测SIRT1、FOXO1、乙酰化(Ac)-FOXO1蛋白水平,双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-199a与SIRT1的靶向关系。结果与正常孕妇组比较,GDM组胎盘中miR-199a、HOMA-IR水平升高(P<0.05);GDM组miR-199a水平与HOMA-IR呈正相关(P<0.05)。棕榈酸、胰岛素共同作用细胞24 h成功建立IR模型。与模型组和miRNA inhibitor NC组比较,miR-199a inhibitor组miR-199a、MDA水平降低,葡萄糖吸收量、SOD水平、SIRT1蛋白水平升高(P<0.05)。与模型组和miRNA mimic NC组比较,miR-199a mimic组miR-199a和Ac-FOXO1蛋白表达升高、MDA水平升高,葡萄糖吸收量、SIRT1蛋白水平降低(P<0.05)。Tarbase数据库分析显示,miR-199a与SIRT1存在互补的结合位点,并经双荧光素酶实验证实。结论GDM患者胎盘中miR-199a高表达,升高的miR-199a可通过靶向下调SIRT1而促进FOXO1乙酰化,导致IR。

FoxO1在小鼠感染流感病毒H1N1中的作用及机制

目的探讨叉头盒转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)在小鼠抵抗流感病毒H1N1感染中发挥的作用及机制。方法用琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠的基因型后,将小鼠分为2组:条件性敲除NKp46^(+)细胞中FoxO1基因的Foxo1^(△NK)组小鼠,以及对照组WT小鼠;2组小鼠使用滴鼻法同1天感染流感病毒H1N1,每天记录小鼠体质量及2组小鼠的死亡情况;在2组小鼠体质量及状态差异明显的第10天取样,HE染色法观察肺组织病理;Luminex液相芯片技术检测肺组织匀浆上清中36种细胞因子的表达情况;流式细胞术检测肺组织免疫细胞的比例变化。结果与WT组相比,感染流感病毒后Foxo1^(△NK)组小鼠死亡率增加,体质量下降更加严重;肺组织病理显示炎症反应减弱;肺组织匀浆上清中的细胞因子表达水平下降,ENA-78、IFN-α、IL-4、IL-5显著降低;肺组织免疫细胞中CD3^(+)NKp46^(+)NKT细胞比例显著下降。结论FoxO1基因的缺失加重了小鼠流感感染进程,可能是通过抑制依赖FoxO1基因调控的CD3^(+)NKp46^(+)NKT细胞相关免疫反应。

MST1通过促进PEPCK的表达调控小鼠肝脏糖异生

目的探讨哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)在小鼠肝脏糖异生途径中的作用及调节机制。方法RT-qPCR检测MST1 mRNA在糖尿病模型db/db小鼠和对照db/m小鼠肝脏组织中的表达。通过腺病毒感染小鼠肝原代细胞,检测MST1过表达后肝细胞的糖输出能力。在HepG2细胞中,运用荧光素酶报告基因实验检测MST1对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)编码基因的启动子活性的作用。利用干扰腺病毒在小鼠肝原代细胞中敲低叉头盒转录因子O1(FOXO1),检测MST1过表达对PEPCK mRNA水平的影响。结果MST1 mRNA在糖尿病db/db小鼠的肝脏组织中高表达(P<0.001)。在小鼠肝原代细胞过表达MST1促进了葡萄糖的输出(P<0.05)。在HepG2中,过表达MST1促进了PEPCK mRNA的表达(P<0.001)和启动子活性(P<0.01)。进而,当敲低FOXO1表达后,MST1诱导PEPCK mRNA表达的作用消失。结论MST1促进PEPCK表达参与调控小鼠肝脏糖异生依赖于FOXO1。

靶向FoxM1基因的短发夹RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向FoxMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰表达载体质粒，为进一步探讨FoxMl在肺部恶性肿瘤及其他疾病中的作用奠定基础。方法化学合成可编码靶向FoxMl基因的siRNA的短发夹DNA（shDNA）片段，通过基凶重组将其插入到线性化的shRNA表达质粒骨架pSilencer2．1-U6中，对得到的新质粒进行酶切鉴定和基因测序。结果所构建的质粒载体中成功插入了可编码靶向FoxMl基因的siRNA的shDNA片段。结论成功构建了靶向FoxMl基因的shDNA表达载体。