基于FOXO3a/Nrf2信号通路探讨尿毒症骨骼肌自噬的分子机制

目的:探讨叉头盒(forkhead box,FOX)O蛋白3a(forkhead box O3a,FOXO3a)/转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号通路的调节尿毒症骨骼肌自噬的机制。方法:24只小鼠随机分为假手术组(Sham组)、慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)组和CKD+AST-120(AST)组,每组8只。通过5/6肾切除术建立CKD模型。在肾切除术后4周,CKD+AST组小鼠给予含AST-120粉末(尿毒毒素的木炭吸附剂)饮食,持续8周。透射电子显微镜观察腓肠肌组织中的自噬溶酶体。C2C12小鼠成肌细胞分为对照(Control,Con)组、硫酸吲哚酚(indophenol sulfate,IS)组、IS+si-FOXO3a组。实时RT-PCR和蛋白质印迹法分析FOXO3a表达情况。Giemsa染色对C2C12肌管直径进行量化。结果:与CKD组相比,CKD+AST组血清IS水平和腓肠肌组织中FOXO3a表达、自噬溶酶体的数量明显降低(P<0.05),以及腓肠肌、胫骨前肌、比目鱼肌质量明显增加(P<0.05)。与IS组相比,IS+si-FOXO3a组C2C12细胞中FOXO3a、肌肉萎缩盒基因(Muscle Atrophy F-box,atrogin-1)肌肉环脂蛋白1(muscle RING-finger protein-1,MuRF-1)的表达和细胞自噬通量明显降低(P<0.05),以及细胞直径明显增加(P<0.05)。与Sham组相比,CKD组小鼠腓肠肌组织中Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,KEAP1)表达明显升高(P<0.05),和NRF2表达明显降低(P<0.05)。AST治疗逆转了CKD小鼠腓肠肌组织中这些蛋白的变化。si-NRF2逆转了FOXO3a敲低对自噬流量的抑制作用。结论:IS可能通过持续刺激FOXO3a-KEAP1-NRF2轴促进骨骼肌过度自噬,参与尿毒症少肌症的发病机制。

小鼠抗人FOXO3保守区多克隆抗体的制备和鉴定

目的纯化叉头盒蛋白O3(FOXO3)基因保守区蛋白,并制备其多克隆抗体。方法利用生物信息学分析预测FOXO3蛋白的保守区,通过PCR扩增编码FOXO3蛋白第290~472位氨基酸DNA片段并克隆至pET28a原核表达载体中,转化到大肠杆菌BL21,诱导表达并获得可溶性蛋白,经镍离子柱亲和纯化,免疫小鼠制备抗血清,随后采用ELISA、Western blot法和免疫沉淀实验检测抗体的效价、特异性以及应用范围。结果成功构建表达载体pET28a-FOXO3(aa290-472),实现可溶性FOXO3蛋白的表达和抗体制备。SDS-PAGE和Western blot实验结果证实,FOXO3蛋白与预期结果一致,抗血清能够特异性地识别原核、真核FOXO3蛋白以及其天然抗原表位。结论成功制备了小鼠抗人FOXO3的多克隆抗体,且抗体对内源性FOXO3具有较好的反应性和特异性。

转录因子FOXO3在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)作为一个重要的临床问题目前临床防治手段仍然有限。转录因子叉头盒蛋白O3(FOXO3)可以通过抗氧化应激、抑制细胞凋亡和线粒体自噬等作用保护心脏组织,在MIRI的治疗中发挥重要作用。本文对FOXO3的结构、调节机制、相关药物应用等方面进行综述,旨在为FOXO3分子在MIRI治疗中的应用提供理论依据。

吉马酮通过FOXO3-FOXM1轴调控甲状腺癌BCPAP细胞的增殖、迁移和化疗耐药

目的:探究吉马酮通过叉头盒蛋白O3(FOXO3)-FOX亚类M1转录因子(FOXM1)信号通路调控人甲状腺癌细胞BCPAP和多柔比星(DOX)耐药BCPAP细胞(BCPAP/DOX)的增殖、迁移和化疗耐药。方法:常规培养BCPAP细胞,用BCPAP细胞构建BCPAP/DOX细胞,用MTT法检测不同浓度吉马酮对BCPAP和BCPAP/DOX细胞增殖的影响。将BCPAP和BCPAP/DOX细胞分为Ctrl组(空白对照)、sh-NC组(转染sh-NC质粒)、低浓度吉马酮组(0.10 mmol/L)、高浓度吉马酮组(0.15 mmol/L)、高浓度吉马酮(0.15 mmol/L)+sh-FOXO3组(转染sh-FOXO3质粒),用转染试剂将sh-NC质粒和sh-FOXO3质粒转至相应的BCPAP和BCPAP/DOX细胞中。用CCK-8法、划痕愈合实验和WB法分别检测各组细胞的增殖、迁移能力,以及FOXO3、FOXM1、BAX、MMP-9和多药耐药-1(MDR-1)蛋白的表达。结果:在BCPAP和BCPAP/DOX细胞中成功地敲减了FOXO3的表达,低浓度和高浓度吉马酮均可显著抑制BCPAP和BCPAP/DOX细胞的增殖、迁移能力,降低细胞中FOMX1、MMP-9或MDR-1(BCPAP/DOX细胞)蛋白的表达,提升FOXO3和BAX蛋白的表达(均P<0.05),与低浓度比较,高浓度吉马酮的作用更为显著(均P<0.05),敲减FOXO3后可部分逆转吉马酮对这两种细胞的作用(均P<0.05)。结论:吉马酮可能通过FOXO3/FOXM1信号通路调控BCPAP和BCPAP/DOX细胞的增殖和迁移能力,降低BCPAP/DOX细胞化疗耐药性。