基于FoxO1通路探讨仙茅苷对H2O2诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用及机制

目的探讨仙茅苷(Curculigoside)对H_2O_2诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用及机制。方法采用H_2O_2(0.3 mmol·L^(-1))处理MC3T3-E1成骨细胞建立细胞氧化损伤模型,并以阳性对照药氮乙酰半胱氨酸(NAC,2.5 mmol·L^(-1))和不同浓度仙茅苷(10^(-6)、10^(-7)、10^(-8)mol·L^(-1))进行干预。采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;磷酸苯二钠法(p-PNPP-Na)法测定成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法观察成骨细胞的骨矿化结节形成情况;ELISA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力;流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)和线粒体膜电位;Western Blot法检测细胞叉形头转录因子1(FoxO1)和SOD-2的蛋白表达水平;免疫荧光组织化学法检测FoxO1、活化转录因子4(ATF4)、β-连环蛋白(β-catenin)在细胞核中的表达。结果与空白对照组比较,模型组成骨细胞在H_2O_2处理36~72 h后,MC3T3-E1细胞的增殖受到显著抑制(P<0.001);成骨细胞活力及ALP活性均明显降低(P<0.05),细胞形成的骨矿化结节的数量和面积明显减少;SOD活性明显降低(P<0.05),CAT活性明显增加(P<0.05);ROS水平增加,线粒体膜电位降低,总FoxO1a、SOD-2蛋白表达下调,FoxO1a在细胞核内的表达下调,在细胞质中的表达上调,在细胞核与细胞质表达的比例降低,但差异没有统计学意义(P>0.05);细胞核中FoxO1a、β-catenin、ATF4表达量升高。与模型组比较,阳性药组和不同浓度仙茅苷组的成骨细胞活力及ALP活性均明显上调(P<0.05),且细胞骨矿化结节的数量和面积明显增加;阳性药组及仙茅苷10^(-6)mol·L^(-1)组的细胞SOD活性明显增加(P<0.05),仙茅苷10^(-6)mol·L^(-1)组细胞的CAT活性明显增加(P<0.05);10^(-7)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞的ROS水平明显降低(P<0.05);仙茅苷10^(-8)mol·L^(-1)组的线粒体膜电位明显升高(P<0.05);阳性对照组和10-6mol·L^(-1)仙茅苷组的细胞总FoxO1a蛋白表达明显上调(P<0.05);各给药组细胞的SOD-2蛋白表达均明显上调(P<0.05);10^(-6)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞FoxO1a在细胞核与细胞质表达的比值明显升高(P<0.05);10^(-6)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞的FoxO1a、ATF4在细胞核的表达上调,β-catenin在细胞核的表达没有明显变化。结论仙茅苷能够保护H_2O_2对MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤,可能与其增加FoxO1在细胞核内的表达,增强FoxO1a与ATF4相互作用,以及增强SOD及CAT活性有关。

松果菊苷调控Sirt1-FOXO1通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的:研究松果菊苷通过调控沉默信息转录调节因子1(Sirt1)-叉形头转录因子1(FOXO1)通路减轻大鼠心肌缺血再灌注(MI/R)损伤。方法:结扎大鼠左冠状动脉前降支30 min,再灌注6 h建立MI/R损伤模型。将大鼠随机分为4组:假手术组、MI/R组、松果菊苷+MI/R组、Sirt1特异性抑制剂EX527+松果菊苷+MI/R组,每组10只,腹腔注射给药。心脏切片后用三苯基氯化四氮唑(TCC)染色测定心肌梗死面积;分光光度法测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量;TUNEL法检测心肌细胞凋亡率;蛋白质印迹法(Western blot)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测sirt1和FOXO1蛋白和mRNA表达水平。结果:与MI/R组比较,松果菊苷+MI/R组大鼠心肌梗死面积、LDH和CK含量、心肌细胞凋亡率、FOXO1蛋白和mRNA表达水平显著降低,Sirt1蛋白和mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与松果菊苷+MI/R组比较,EX527+松果菊苷+MI/R组大鼠心肌梗死面积、LDH和CK含量、心肌细胞凋亡率、FOXO1蛋白和mRNA表达水平显著升高,而Sirt1蛋白和mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论:松果菊苷能够减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与调控Sirt1-FOXO1通路有关。

下调miRNA-217对UVB诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤及Sirt1/FOXO1通路的影响

目的探讨下调微RNA-217(miRNA-217)对中波紫外线(UVB)诱导的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)氧化损伤及沉默信息转录调节因子1(Sirt1)/叉形头转录因子1(FOXO1)信号通路的影响。方法将未损伤和UVB损伤的HFF-1细胞分为正常组、对照组、miRNA-217阴性对照(NC)组和miNAR-217抑制剂组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miRNA-217表达情况;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞生长情况;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)法检测细胞凋亡情况;2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCHF-DA)荧光探针法检测活性氧(ROS)表达;过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒检测该指标水平;Western blot检测Sirt1、FOXO1和乙酰化FOXO1(Ac-FOXO1)蛋白表达。结果与对照组和miRNA-217 NC组比较,miRNA-217抑制剂组HFF-1细胞miRNA-217、凋亡率及MDA、ROS、Ac-FOXO1蛋白表达和Ac-FOXO1/FOXO1比值明显降低(P<0.05),细胞存活率、CAT、SOD表达水平、Sirt1和FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05);对照组与miRNA-217 NC组上述各指标水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与正常组比较,对照组上述各指标变化呈相反趋势。结论下调miRNA-217可能通过促进Sirt1/FOXO1信号通路,保护UVB诱导下HFF-1细胞免受氧化损伤。