友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。

友菌素抑制人卵巢癌细胞增殖侵袭及迁移的机制研究

目的探究友菌素对人卵巢癌细胞株skov3增殖、侵袭及迁移的影响及作用机制。方法体外培养人卵巢癌细胞skov3,MTT比色法检测不同浓度友菌素对人卵巢癌细胞株skov3增殖活力的影响;Transwell法和划痕法检测友菌素对人卵巢癌细胞株skov3体外侵袭、迁移的影响;Western blotting检测不同浓度的友菌素诱导人卵巢癌细胞株skov324 h后,细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、β-连环蛋白(β-catenin)及C-myc癌基因蛋白(C-myc)的表达情况。结果友菌素对skov3的IC 50为7.436μmol/L,发现其具有抑制侵袭、迁移能力,并且下调MMP-2、β-catenin及C-myc蛋白表达,与对照组相比差异均有统计学意义。结论体外实验表明,友菌素抑制人卵巢癌细胞株的增殖、迁移及侵袭,并且激活Wnt/β-catenin信号通路。