抗转铁蛋白受体双价抗体的构建、表达及鉴定

目的:抗转铁蛋白受体(TfR)双价抗体(bsFv)构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定。方法:以抗TfR的单链抗体(scFv)为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增两条scFv片段,将其连接并克隆至原核表达载体pAB1,转化大肠杆菌TG1,阳性菌经IPTG诱导表达,FCM检测bsFv与K562,HepG2肿瘤细胞结合的活性及特异性。结果:酶切鉴定及DNA测序证明该bsFv构建成功;SDS-PAGE、Western blot鉴定表明表达蛋白分子量与bsFv理论值一致;FCM结果证明bsFv可与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合,且结合的阳性率较scFv有所提高。结论:成功构建了抗转TfR的bsFv,且能与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合。

肝癌细胞特异性结合双价抗体的构建表达与鉴定

目的构建和表达与肝癌细胞特异结合的双价单链抗体(bivalentsingle-chainFv,BsFv),并鉴定该双价抗体的生物活性。方法以与肝癌细胞特异结合的单链抗体(scFv)为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过聚合酶链反应(PCR)方法扩增出两个scFv片段,将其连入原核表达载体pAB1;构建的表达载体转化大肠埃希菌TG1,挑取单克隆细菌进行扩增,提取质粒酶切、测序鉴定。阳性菌经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Westernblot鉴定,间接免疫荧光流式细胞术(FACS)测定与肝癌细胞特异结合的特性。结果经酶切鉴定以及DNA测序结果表明该BsFv构建成功,SDS-PAGE、Westernblot鉴定表明表达蛋白相对分子量与BsFv理论值一致,且表达产物同亲本scFv比较,与肝癌细胞特异结合活性增强。结论BsFv构建成功,BsFv较scFv具有明显优势,为其用于临床肿瘤的诊断和治疗奠定了基础。

基因工程双价抗体在肿瘤中的研究进展

基因工程抗体技术的发展加速了单链抗体的应用,但其稳定性差,亲和力低,功能单一,体内清除过快等特点影响了它的广泛应用。双价抗体作为一种新型小分子抗体,具有双价的结合位点,能够使抗原分子上的两个表位交联或使两个分子连接,可以模拟完整的单克隆抗体的抗原抗体反应,其构建方法有亮氨酸拉链法、利用部分抗体恒定区法、连接肽法、利用双聚化结构法、knobs into holes技术等,在乳腺癌、直肠癌、淋巴瘤等的诊治方面均有很好的应用价值。

抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性

目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应。方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL。SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆。IMAC纯化并定量抗体。免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响。结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株。培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L。抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2%及70.6%。经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37%。结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应。

抗人CD80双价抗体的构建、表达及生物学功能初步研究

构建及表达抗人CD80双价抗体(dimeric antibody fragment,diabody),并初步研究其生物学功能。PCR法获得轻重链可变区基因,构建表达载体pIRES2-EGFP/diabody。将pIRES2-EGFP/diabody转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压,筛选稳定高表达细胞株,扩大培养并收集上清,经镍柱纯化,并经变性及非变性SDS-PAGE电泳对抗体分子的双体性进行鉴定。采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析抗体与细胞膜型CD80分子的结合活性及与鼠源性亲本抗体4E5的竞争抑制效应;MTT法分析该抗体对天然高表达CD80的Raji细胞体外增殖的影响。结果:成功构建抗人CD80-diabody表达载体并含有编码信号肽和Gly4Ser连接肽的序列。获得了稳定分泌双价抗体的细胞株(命名为SA-Ⅲ),培养上清中纯化抗体的得率为50 mg/L,PAGE结果显示其为一个二聚体,Mr约为53 000(抗人CD80-ScFv Mr约为27 000)。抗CD80-diabody与L929-CD80、Raji及Daudi的阳性结合率分别为96.5%、98.1%及93.0%;该抗体对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的抑制率为97.11%,对Raji细胞体外增殖的抑制率达31.27%。与单链抗体相比,亲和活性明显提高。成功建立了抗CD80-diabody CHO细胞的表达株,其分泌的抗体具有良好的生物学活性。

CD80双价抗体对降植烷诱导的小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应研究

目的 运用CD80双价抗体抑制CD80/CD28信号通路,研究观察双价抗体对小鼠狼疮样肾炎的逆转效应并探究其分子机制.方法 运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型,一次性腹腔注射0.5 ml降植烷（Pristane）,4个月时小鼠出现蛋白尿,外周ANA、抗dsDNA抗体水平也明显升高,模型建立成功.取成模小鼠分为2组,CD80双价抗体干预组：每只小鼠分别于第1、3、5、8、15天尾静脉注射200μg CD80双价抗体,随后3个月每隔1个月注射1次;模型组注射同型蛋白,给药方式及剂量与双价抗体干预组相同.同时设立正常对照组.Albustix试纸法监测小鼠尿蛋白动态变化,流式细胞术分析脾脏中免疫相关细胞的活化程度,间接免疫荧光法检测小鼠血清中自身抗体（ANA和抗dsDNA抗体）的表达水平及IFN-γ、IL-4的含量,取肾脏组织进行HE染色分析、免疫复合物（IC）检测.结果 小鼠尿蛋白显示双价抗体干预组的尿蛋白程度显著低于建模组,差异有统计学意义（P＆lt;0.05）;流式细胞术分析双价抗体干预组脾脏中巨噬细胞（CD11b＋）、树突状细胞（CD11c＋）、中性粒细胞（Gr1＋）及B细胞（CD21＋）活化程度显著低于模型组（P〈0.05）,并且T细胞中CD4＋、CD154＋细胞数量干预组明显少于模型组（P〈0.05）;血清中ANA、dsDNA的阳性率和滴度干预组低于模型组,差异有统计学意义（P〈0.05）;干预后小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量与建模组相比出现下降,差异具有统计学意义（P〈0.05）;肾脏HE染色和免疫荧光结果显示,肾小球炎症损伤和坏死程度减轻,肾脏免疫复合物沉积情况减少.结论 CD80双价抗体高效特异地结合抗原提呈细胞表面的CD80分子,阻断了CD80/CD28协同刺激信号,下调机体的免疫应答,对小鼠狼疮样肾炎病理损伤具有缓解和逆转作用.

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性双价纳米抗体原核表达及活性鉴定

以猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VHH_(cap)基因为模板,通过PCR分别克隆下游片段VHH_(down)和带(G_(4)S)_(3)-linker接头序列的上游片段VHH_(up),通过两步酶切连接反应,将VHH_(down)片段插入到pCold-SUMO载体中构建VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒,再将VHH_(up)片段插入到构建成功的VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒中,构建双价单特异性纳米抗体原核重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,表达产物经Ni^(2+)亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE鉴定;通过间接ELISA方法测定纯化后的双价纳米抗体重组蛋白biVHH_(cap)的效价水平,并与相同浓度的单价纳米抗体蛋白VHH_(cap)的ELISA效价进行比较分析。结果表明,重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO构建正确,Cap蛋白双价单特异性纳米抗体重组蛋白在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为45 ku;该双价纳米抗体与其单价组分相比,ELISA抗体效价提高约20倍,Cap蛋白双价纳米抗体的制备为PCV2的抗原检测和PCV2相关疾病的防控提供了新型候选抗体工具。

人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取

目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody)。方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析。选取活性好的抗体基因进行改造,构建diabody。结果:在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因,分泌抗Dig抗体的阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第1亚群,重链基因分别属于第3和第4亚群。选取4号克隆进行基因改造,构建diabody的表达载体,获得活性较好的diabody。结论:利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗Dig的抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物的中毒提供了具有实用价值的人源抗体。

双特异性抗体药物的研究进展

双特异性抗体是一类具有双功能的抗体分子,可以同时特异性结合2个不同的抗原。由于其特异性和双功能性,现已成为抗体工程领域的研究热点,在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。目前,至少有30多种双特异性抗体药物处于临床研究阶段。本文主要对双特异性抗体药物的开发历史、分子结构和设计策略、作用机制等进行简要综述。