黄瓜花叶病毒和番茄花叶病毒双价抗性RNA沉默表达载体的构建

利用基因沉默的原理构建了能转录产生dsRNA,诱导植物发生RNA沉默的沉默载体。根据已报道的番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(Rep)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到△MP基因片段和Rep基因片段;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为711bp的融合基因△MP-Rep。将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,得到含有融合基因反向重复序列的重组质粒pBlue SK-Intron△MP-Rep(i/r)。再用限制性内切酶BamHⅠ切下包含Intron在内的反向重复的融合基因,并定向插入到植物表达载体pBIN438上,构建了含2种病毒基因的植物表达载体pBIN438△MP-Rep(i/r)。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。该研究结果为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。

PVY、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了PVYCP基因、PVYHC-Pro基因、CMVCP基因和CMV2b基因的保守片段,分别将PVYCP片段和CMV2b片段、PVYHC-Pro片段和CMV2b片段、PVYHC-Pro片段和CMVCP片段连接起来,以此为靶标构建并得到3个RNA沉默表达载体pCAMPb、pCAMHb和pCAMHP。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。

dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建

[目的]构建通过表达dsRNA,诱导植物基因沉默机制可抗2种病毒的表达载体。[方法]根据已报道番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(2b)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到部分△MP和2b基因;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为676 bp的融合基因△MP-2b。再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游。[结果]构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438△MP-2b(i/r)。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。[结论]为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。