双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究

多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。

植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

背景:出于对转基因植物的食用安全和生态安全的考虑,标记基因的存留是影响转基因植物的首要安全问题。目的:基于免疫防龋原理,课题组针对表面蛋白和葡糖基转移酶这2种致龋毒力因子,构建植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8,为转基因植物疫苗的研发提供基础。方法:该研究运用DNA重组技术,通过DNA片段分离、连接、转化、克隆子检测、测序等系列步骤,将植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中的选择性标记基因Km和GUS去除。结果与结论:标记基因去除效率达99%,该研究为免疫防龋的转基因植物疫苗的安全生产奠定了良好的实验基础,也为其它植物疫苗的载体构建提供思路。

双价抗虫基因植物表达载体的构建

将蝎毒基因BmKITS和几丁质酶基因chitinase2个抗虫基因采用不同的启动子ubi或35S,连到2个高效的植物表达载体pWM101和pBI101中,2个重组表达质粒分别经过限制性酶切分析和PCR鉴定,实验结果表明2个含有双价抗虫基因的植物重组表达质粒均已构建成功.

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1(+)和pBISR1(-)。通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1 基因导入烟草Ha vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株。经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状。

Chi-linker-Glu融合基因双价植物表达载体的构建及其相关鉴定

将木霉几丁质酶基因Chi和β-1,3-葡聚糖酶基因Glu通过8个中性氨基酸连接起来,形成Chi- linker-Glu融合基因.其中编码区基因长2376 bp,共编码792个氨基酸和一个终止子.将该融合基因克隆到中间载体pAHC25中,然后将整个ubi-chi-linker-glu-nos表达盒插入用ubi-bar-nos表达盒代替CaMV35S-gus-nos的高效植物表达载体pBI121中,构建了双价抗真菌基因的重组质粒pBIb-CG,并通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草.PCR扩增和PCR-Southern分析证明已将Chi-linker- Glu融合基因整合到烟草基因组中.

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。

抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus ret-roflexusagglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白。把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功。将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株。

江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白编码基因的克隆和表达分析

旨在通过对江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白编码基因进行克隆和表达分析,为揭示江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白的生物学功能提供理论依据。从江西铅山红芽芋试管苗转录组数据库中筛选到江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白编码基因的核心片段,用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白编码基因,并采用生物信息学方法和实时定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明,江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白编码基因的cDNA总长度为534 bp,G+C含量为58.05%;江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白由177个氨基酸组成,相对分子量为19369.13 u,等电点为6.09,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(15.25%)、β-片层(27.68%)、无规则卷曲(57.06%)构成;三级结构为同源三聚体;江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白主要存在于细胞质、叶绿体中;江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白在进化上与芋(Colocasia esculenta)的亲缘关系较近,尤其是与C.esculenta hypothetical peotein Taro_046195(MQM13270.1)在进化上具有最高的亲缘关系。实时定量PCR结果显示,植物抗病反应蛋白编码基因在江西铅山红芽芋中的表达存在器官特异性,在茎、球茎膨大末期的表达量最高。由结果可知,江西铅山红芽芋植物抗病反应蛋白具有典型的植物抗病反应蛋白的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种的相似度较高,在进化上高度保守,对进一步揭示该酶的生物学功能具有重要意义。

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物,以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因,全长959 bp,编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因,利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体,为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。

大白菜BrCYP83B1基因的克隆及表达分析

【目的】细胞色素P450家族是十字花科植物硫苷合成重要的酶系,其中CYP83亚家族主要参与核心结构的合成,旨在探究大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)CYP83B1基因的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆BrCYP83B1基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白理化性质、同源性及启动子顺式作用元件,利用RT-qPCR技术分析BrCYP83B1的表达模式,并构建其植物超表达载体。【结果】BrCYP83B1 cDNA序列全长为1500 bp,编码499个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450超家族,主要定位于细胞质,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与甘蓝型油菜、青花菜的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。启动子分析表明,该基因启动子区域包含水杨酸、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应的顺式作用元件,说明BrCYP83B1基因表达可能受激素调控。RT-qPCR分析结果表明,BrCYP83B1基因在大白菜的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;茉莉酸甲酯够显著促进该基因的表达,而水杨酸处理对其表达具有一定的抑制作用,脱落酸处理下基因先上调后又下调。【结论】BrCYP83B1可能参与大白菜对激素的响应调控。

NPR1和Defensin双价抗病基因过量表达载体构建及其对沙田柚的遗传转化

通过PCR技术,从克里曼丁橘和荔枝品种"三月红"叶片中克隆获得了NPR1和Defensin基因序列.以p BI-121作为载体骨架,构建了NPR1和Defensin双价抗病基因过量表达载体,命名为ND-p BI121.通过根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了6株PCR检测为阳性的双抗沙田柚植株,为探究NPR1和Defensin基因的过量表达对柑橘黄龙病的抗性影响提供试材.

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从类产碱假单胞菌YS1(PseudomonaspsuedoalcaligeneseYS1)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因 :phaC1、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对 phaC1基因进行了改造 ,经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2 (嵌合 phaC2 )和 pC3C1C2 (嵌合 phaC1和 phaC2双基因 )。将构建好的嵌合 phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体 pC3C1C2 ,用冻融法转入根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumtumefaciensEHA10 5 )并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 (NicotianatobacumHonghuadajinyuan)。 2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株 ,抗性植株大田生长表型正常 ,生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR Southern、Southern检测初步确定有 32 %烟草稳定整合了 phaC1和 phaC2。用氯仿 -次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA ,在产物合成水平确证有 2 5 6

多基因植物表达载体的构建

将功能互补的抗真菌病基因或抗虫基因共同转化水稻植株 ,可望获得既抗病又抗虫的转基因水稻植株。马铃薯蛋白酶抑制剂 基因 Pin ,苏云金杆菌毒蛋白 Cry ( b)基因 B.t.,以及 PPT乙酰转移酶基因 bar构建在一个载体上。水稻碱性几丁质酶基因 RC2 4与大麦核糖体失活蛋白基因 B- RIP构建在另一个载体上。两载体共同转化水稻植株的工作正在进行之中。

植物基因工程表达载体的改进和优化策略

外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究者困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担忧。本文简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略 ,这些策略有助于增强外源基因的表达水平、提高生物工程体的安全性。

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将

香石竹ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据已发表的ACO核苷酸序列 ,设计一对引物 ,以香石竹品种‘American’基因组DNA为模板 ,扩增出香石竹ACC氧化酶基因 ,将其连接到pMD18加T质粒载体上 ,通过中间载体pBluescriptSK ,构建了ACO基因正向和反向插入的植物表达载体 ,并将其导入了农杆菌。酶切检测表明该片段已插入表达载体 ,序列测定结果显示所克隆基因片段含 3个外显子 ,2个内含子 ,其中

细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆及其植物表达载体的构建

利用 PCR技术从油菜 Polim a不育系中扩增出细胞质雄性不育相关基因 orf 2 2 4 ,并将其克隆到p GEM- T Easy载体上得到重组质粒 p GEMORF。在此基础上 ,用限制性内切酶将 orf 2 2 4基因从质粒 p GEMORF上切下 ,连接在 p BI12 1质粒的 Ca MV 35 S启动子和 NOS终止子之间。经 PCR和酶切鉴定 ,得到了 orf 2 2 4基因的植物表达载体 p