马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草质体基因组全序列设计合成引物,PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化,结果表明,GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达,经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光,在距离为6cm,压力1100psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明,GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%-30.2%,均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。

gfP基因甘蓝质体表达载体构建及原核表达分析

以甘蓝自交系‘03097’为试材,PCR扩增并克隆了甘蓝质体的trnI-trnA基因区段,利用该基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了甘蓝质体定点转化载体,并进行了原核表达分析。结果表明,所扩增的基因区段大小为2.7 kb。进行序列分析后,经酶切、连接和转化,构建成含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的质体表达载体,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计;gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下高水平表达,表达量约占总可溶性蛋白的41.0%,包涵体占菌体蛋白的38.0%。该载体的构建为后期甘蓝质体转化体系的建立和其它功能基因导入甘蓝质体进行性状改良奠定了基础。

豌豆早期结瘤素基因ENOD12A的克隆及与PsLectin基因双元表达载体的构建

采用PrimStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsENOD12A.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的序列仅相差1个碱基,但推导的氨基酸序列没有改变.将PsENOD12A基因和豌豆凝集素基因psl重组进了双元表达载体.

生菜质体表达载体构建及gfp基因原核表达分析

以四季耐抽薹生菜为材料,PCR扩增并克隆了生菜质体rpo A基因的两侧翼的基因片段,利用该两基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了生菜质体定点转化载体p Brpo A-GFP,并进行了原核表达分析。结果表明,PCR所扩增的两条基因区段大小为1.2与1.1 kb。进行序列分析后,经酶切、连接和转化,构建成含Prrn-gfp-aad A-Tpsb A表达盒的质体表达载体,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计;gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子Tpsb A的调控下高效表达,表达量约占总可溶性蛋白的45.6%,包涵体占菌体蛋白的47.5%,该载体的构建为后期生菜质体转化体系的建立和其它功能基因导入生菜质体进行性状改良奠定了基础。

FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的 构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法 使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果 重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论 本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 。

新型HMW-GS基因1Dy12.1^(*t)植物双元表达载体的构建及其遗传转化

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weightglutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1*t为目的基因,利用限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ切割后5’端能形成相同粘性末端的特性,成功构建了1Dy12.1*t的植物双元表达载体pBINHP-GluT。该载体选择使用胚乳特异性强启动子,利用已知HMW-GS基因内部均不含有的XbaⅠ和KpnⅠ内切酶位点引入1Dy12.1*t编码区,并将1Dy12.1*t的表达调控置于T-DNA区内,从而奠定了其在不同HMW-GS基因功能活性研究上的便利性。通过根癌农杆菌烟草叶盘转化研究目的基因1Dy12.1*t在植物体的表达特性,SDS-PAGE和western blotting鉴定结果表明,1Dy12.1*t在转基因烟草种子胚乳中得到高效表达,进一步证实了所克隆基因的正确性和所构建载体的有效性。

拟南芥PhrIP1基因超表达、GFP和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。

口蹄疫病毒vp1基因的克隆与植物双元表达载体的构建

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构蛋白基因vp1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438,构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinFMDV-VP1。结果表明:vp1基因为639bp。重组中间表达载体pBinVP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明vp1基因、Kozak序列等插入pBinVP1中。在含50mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和50mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行vp1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pBinFMDV-VP1构建正确。

新型柞蚕双元基因转移载体的构建及在Sf9细胞中的表达

启动子、转座子、报告基因等转基因元件的优化以及基因转移载体的构建对外源基因的表达尤为重要。利用TAILPCR方法延长柞蚕丝素蛋白基因Fib的5′端和3′端序列,插入柞蚕肌动蛋白基因A1启动子驱动的红色荧光蛋白基因,并利用piggyBac转座子元件构建新型柞蚕双元基因转移载体pBac[A1-DsRed+Fib-GFP]-A1-piggyBac。通过对Sf9细胞的转染实验,证明该双元基因转移载体系统能行使正常功能,而且比传统的双质粒载体转移系统具有更高的整合效率,在柞蚕转基因研究中具有应用潜力。

GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究

本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的ＧＦＰ－ｐ１６融合基因表达载体ｐＣｐ１６Ｇ和ｐＣＧｐ１６分别导入ＢＨＫ、ＨｅＬａ细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达。结果表明，外源脂质体对ＢＨＫ、ＨｅＬａ等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，ｐ１６基因与ＧＦＰ基因的３′端连接，可以保持ＧＦＰ的荧光特性，表达荧光蛋白，而与ＧＦＰ基因的５′端连接，则不能表达荧光。

以UPS构建的酿酒酵母表达载体及GFP的表达

利用通用载体质粒融合系统UPS构建出了以GFP(绿色荧光蛋白 )为报告基因的酵母表达载体 ,经PCR、电泳、测序等手段证明了构建的准确性 。

一个含LoxP-FRT重组酶位点及易于操作的植物表达双元载体pYBA100

在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。

SeNHX1与GFP融合基因在酵母中表达及其耐盐性表现

通过构建盐角草的液泡型Na^＋／H^＋反向转运蛋白SeNHX1基因的酵母表达载体，研究该基因对酵母耐盐性的影响。将SeNHXI基因与荧光报告基因GFP融合，分别构建酵母表达载体pYES2-SeNHX1-GFP、pYES2-SeNHX1和pYES2-GFP，转化酵母W303，诱导3个载体表达，并测定含有不同表达载体的酵母生长曲线。结果表明，荧光显微镜下观察到带有报告基因GFP的2个转化子W303（pYES2-SeNHX1-GFP）和W303（pYES2-GFP）均可发出绿色荧光，而没有报告基因的转化子W303（pYES2-SeNHX1）不发出荧光；在含有0．8mol／LNaCI培养基中培养0～48h内，W303（pYES2-SeNHX1-GFP）和W303（pYES2-SeNHX1）菌株前期生长比对照菌株W303（pYES2-GFP）慢，但在培养48h后则大大超过对照菌株。表明所构建带有目的基因SeNHX1的酵母表达载体已表达，且证实SeNHX1基因可提高酵母的耐扑件。

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1(+)和pBISR1(-)。通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1 基因导入烟草Ha vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株。经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状。

MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖及分化的影响

为了确定MSTN RNAi双元表达载体pEGFP-N1-M1-M2对成肌细胞增殖和分化的影响,利用脂质体介导法将该双元表达载体转染成肌细胞,MTT法检测MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖的作用,Giemsa染色检测pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体对成肌细胞融合率的影响。试验结果表明,pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体有促进成肌细胞增殖和分化的作用,能够促进成肌细胞大量融合。该结果为进一步探讨MSTN基因的作用机理提供了更为便捷的研究方法。

不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因(GLDH)cDNA片段克隆与RNAi表达载体构建

根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。

Anti-SAD基因植物表达载体的构建

硬脂酰 ACP脱饱和酶 (SAD ;EC 1.14.99.)是植物中广泛存在的酶系 ,在脂肪酸合成途径中脱饱和的起始阶段中起催化作用 ,在脂肪酸饱和度调控中起着关键作用。本研究通过对已克隆的硬脂酰 ACP脱饱和酶基因分析 ,合成了SAD基因保守区域基因片段 ,并将该片段插入载体pIG12 1的SacI位点 ,构建了Anti SAD植物表达双元载体 ,为进一步开展植物脂肪酸成份基因工程调控研究提供了基础。

MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验

为了建立有效抑制MSTN基因表达的方法,本试验利用基因克隆技术构建MSTN RNAi双元表达载体,并利用脂质体介导转染成肌细胞、用SDS-PAGE和Western blottingf法检测蛋白质的表达。试验结果表明,以TA载体为克隆载体,pHANNIBAL为中间载体,可成功构建pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体,将其转染成肌细胞48h后,该双元表达载体可明显抑制成肌细胞MSTN基因的表达。