双光子成像在皮肤科的临床应用进展

双光子显微镜(two-photon microscopy, TPM)是一种基于双光子激发荧光(two-photon microscopy, TPEF)和二次谐波产生(second harmonic generation, SHG)对皮肤组织进行非侵入性光学检测的方法,无需荧光染料,具有更精准成像、穿透组织更深、对细胞和组织的光损伤和光毒性更小等优势,在皮肤科疾病辅助诊断及治疗效果监测等诸多方面具有广泛应用前景。

基于二次谐波和双光子激发荧光相结合的非线性光学成像技术在医学中的应用

1961年，Franken等使用红宝石激光器发出波长为694nm的激光穿过石英晶体，产生波长为347nm的紫外光，这是最早观察到的光学二次谐波（secondharmonicgeneration，SHG）现象，标志着非线性光学的诞生。1986年，Freund等怛首次将SHG用于老鼠尾腱的胶原纤维成像，

基于双光子激发荧光和二次谐波产生的非线性光谱分辨成像技术用于皮肤瘢痕的研究

病理性瘢痕不但可以导致患者畸形,影响美观,还可引起功能障碍,奇痒,甚至发生癌变。目前对瘢痕的形成机制尚不完全清楚,使得它的预防和治疗一直是困扰皮肤科和整形外科的难题。要从根本上预防和治疗瘢痕,寻求新的方法和技术已经成为创伤修复研究与揭示瘢痕产生、发展等内在规律的关键。以二次谐波产生和多光子激发荧光作为信号源的多光子显微技术,因其对组织微结构的高灵敏度和高空间分辨成像、对生物组织的低杀伤性和成像深度深等特点,而在生物医学领域得到了广泛的应用。通过对瘢痕研究进展的综述,探讨基于双光子激发荧光和二次谐波产生的多光子显微成像技术用于瘢痕研究的关键问题和应用前景。这种技术有望实现在临床医学中通过早期无损探测和实时监测等方式对病理性瘢痕进行预防和治疗,从而解决由于理想的实验动物模型的缺乏而限制人类对病理性瘢痕的临床和实验室的研究进展问题。

双光子激发荧光成像技术对小鼠植入前胚胎的实时观测

双光子激发的蓝移效应可使利用同一束超快激光同时激发多种不同荧光特性的生物荧光染料的设想得以实现。选取锁模飞秒掺钛蓝宝石(Ti-sapphire)激光器输出的730nm激光,分别激发Hoechst33342,Fluo-4,PI和Indo-1四种常用生物荧光染料,分别利用(455±15)nm,(540±15)nm,(580±16)nm和(500±15)nm四种滤光片获得特异性荧光图像。结合双光子激发荧光成像技术穿透深,光损伤小,信噪比好等优势,选取合适的荧光染料组,应用单束激光激发、双染双通道成像方法,对小鼠植入前胚胎内细胞中的钙信号和染色体进行三维、四维实时成像,为探究小鼠植入前胚胎发育规律提供一种全新的多参数观测手段。

基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术

采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命,时间相关单光子计数采用多波长通道同时记录荧光光子数,可以提高计数效率和信息量,还可以在稳态图像中分离不同荧光团,形成4维图像。并采用多光子激发技术,利用长波长光源发出的两个或多个光子可以激发出一个短波长的光子。多个光子必须几乎同时到达激发点,才能提供被激发分子足够的能量以产生荧光。多光子激发波长较长,生物组织对其散射减小,因而可以穿透到更深层的组织,从而提高荧光成像深度和空间分辨力,并减少对活体样品的损伤。

纳米金标记活细胞双光子荧光成像研究

阳离子纳米金是纳米金微粒与多聚L赖氨酸的结合物,在生理pH值条件下,标记在原代培养小鼠上皮成纤维细胞的阴离子位点.采用双光子荧光(two-photo fluorescence,TPF)显微和荧光寿命成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技术,对阳离子纳米金标记的成纤维细胞进行二维和三维成像,可对小鼠皮肤重建过程中的成纤维细胞进行跟踪.

罗丹明B的飞秒双光子荧光显微成像研究

利用宽带飞秒振荡器作为激发光源搭建了双光子荧光显微成像系统,在飞秒脉冲的宽带激发下,测量了罗丹明B溶液的双光子荧光光谱,开展了罗丹明B固体样品的双光子荧光显微成像研究。在双光子荧光显微成像研究中,通过调节激发脉冲的功率,分析了双光子荧光强度和激发脉冲功率之间的关系,并且利用半波片改变线偏振激发光场的偏振方向,研究了双光子荧光强度随激发脉冲偏振方向的变化趋势,实现了双光子荧光强度的类正弦调制。

细胞内铜离子的双光子荧光成像(英文)

基于无荧光的螺环结构与具有荧光的开环酰胺的平衡反应,本文合成了一个能在水基的缓冲溶液中选择性地识别Cu2 +的罗丹明衍生物FD2 .当在HEPES缓冲溶液中加入10当量的Cu2 +时,FD2的单光子激发荧光和双光子激发荧光的强度均表现出明显的增强;更为重要的是,运用双光子荧光显微技术可以选择性地对活细胞内Cu2 +进行成像.

阳离子胶体金标记活细胞阴离子位点的双光子荧光成像及其应用

使用阳离子胶体金标记中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的阴离子位点,并采用双光子荧光显微成像和荧光寿命成像技术记录活细胞的阴离子场分布.阳离子胶体金是纳米量级金微粒与多聚L-赖氨酸的结合物,金纳米微粒在超短激光脉冲的照射下可以产生高度局域化的光热效应.当飞秒激光脉冲聚焦在细胞膜上标记的金纳米微粒时会产生这种纳米尺度的微光热效应,并在不影响细胞活性的前提下暂时提高细胞膜的通透性.基于这种效应,使用聚焦的飞秒激光脉冲三维扫描照射CHO-K1细胞,将分子质量为10ku的荧光探针大分子异硫氰酸荧光素葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-D)递送到CHO-K1细胞的内部,并用双光子荧光图像记录其递送的过程.使用流式细胞仪分析不同实验条件下FITC-D的转导率和细胞死亡率的关系.

脉冲压缩在双光子荧光显微成像中的应用研究

本刊讯自20世纪90年代末，双光子荧光显微成像技术已经逐步成为利用光学手段研究生物组织和细胞的重要工具。由于双光子激发属于非线性光学过程，

多光子成像技术的生物医学应用新进展

多光子成像技术由于具有低侵入性、强穿透力、高空间分辨率等优点,自问世以来便成为生物医学研究的有力工具,在癌症病理、神经疾病及脑功能成像等方面取得了一系列较好的研究成果.目前,应用较为广泛的多光子成像技术是双光子激发荧光显微成像技术,其在生物医学应用中具有较大的发展潜力.本文详细阐述了多光子成像技术在多色成像、功能成像及成像深度等方面的生物医学应用新进展,包括多色双光子激发荧光显微成像、双光子激发荧光寿命显微成像、双光子光纤内窥成像和三光子显微成像技术,并简要介绍这几种多光子成像技术的原理与特性,最后展望其未来发展前景.

基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

建立一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光寿命显微测量系统,同步扫描相机的重复工作频率为76MHz,利用钛宝石飞秒激光器作为光源,通过可调延时器和标准具对扫描相机的时间分辨率、扫描速度以及非线性等进行标定.该系统的时间分辨率为9ps,非线性小于4%,量程为2.8ns.测量了荧光染料Rose Bengal(RsB)的荧光衰减曲线,通过最小二乘法对荧光的衰减曲线进行拟合,得到RsB的荧光寿命为763ps,与标准荧光染料对比一致.

单分散上转换纳米荧光微粒的荧光寿命测量

为了表征上转换纳米荧光微粒的发光特性,设计了一个可以对单个纳米微粒进行荧光寿命测量的系统。该系统首先使用基于检流计振镜的双光子显微镜系统对单分散状态的上转换纳米微粒样品进行扫描成像。然后,通过单分子荧光纳米定位算法精确找出每个纳米微粒的准确位置,再依次将激光聚焦到每个纳米微粒上,在该点施加一个500μs宽度的激光脉冲,并通过光电倍增管探测随时间变化的荧光强度信号。最后对荧光衰减曲线进行拟合,计算得到该纳米微粒的荧光寿命。实验结果表明:单个上转换纳米荧光微粒的荧光发射曲线符合单指数衰减规律,其荧光寿命为195.3μs。与之相比,聚集状态的纳米微粒的荧光寿命为358.9μs。这表明聚集状态对上转换纳米微粒的发光特性有显著影响。

双光子荧光寿命成像在肿瘤诊断研究中的应用

双光子荧光寿命成像技术在对生物组织进行高分辨三维成像的同时能获得生物组织的生化特性信息,实现结构和功能的精细定量表征,为生物组织的非侵入、无标记、活体成像提供了一种强有力的工具。该技术在肿瘤检测方面具有广阔的临床应用前景,已成为当前生物医学领域研究的热点之一。首先简要介绍了双光子荧光寿命的概念和常用检测方法;其次,结合课题组开展的胃癌和神经胶质瘤诊断等相关研究成果,详细介绍了双光子荧光寿命成像技术在消化道肿瘤、脑肿瘤及皮肤癌等肿瘤检测方面的最新研究进展;最后展望了该技术在未来临床应用中的潜在优势和可能面临的挑战。

双光子激发钠分子荧光寿命的测量

本文研究了钠分子高位三重态荧光寿命的测量方法。利用倍频晶体模拟等频双光子激发过程和对荧光衰变曲线求卷积的数值计算方法。有效地消除了测量仪器响应函数的影响,测量了Na_2高位三重态2~3∏_g→a^3∑_u^+的荧光寿命。

双光子激发时间分辨荧光光谱测量技术

建立了一台基于高重复频率扫描相机的双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统,能够同时测量样品的荧光光谱和寿命.该系统的时间分辨率为6·5—200ps,光谱分辨率为1—3nm,能够实现快速数据采集以及可靠和可重复的寿命和光谱测量.利用标准荧光染料(若丹明6G、香豆素314)及其混合溶液对该系统进行了测试,所得到的荧光光谱分布和寿命值与文献报道一致.实验结果表明,该系统能有效区分多组分荧光团.这为鉴别多荧光团或多组分生物组织提供了一种独特的对比方法,可用于多光谱分辨荧光寿命成像和荧光共振能量转移成像等方面.

多光子技术及其应用研究进展

本文综述了多光子技术的基本物理原理，多光子激发成像技术特点以及其在生物，化学和材料科学等方面的应用。

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义.

双光子荧光探针

双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。荧光显微成像是研究活体生物的重要工具,而最通常的细胞成像方法则是使用单光子激发荧光团的单光子显微成像。近红外光源激发的双光子荧光探针克服了单光子荧光探针的光漂白与光致毒而更适于生物检测与成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具。双光子荧光探针的作用机理包括分子内电荷迁移(ICT)、荧光共振能量迁移(FRET)、光诱导电子迁移(PET)与基团转换(GC)4种方式。该文综述了双光子阳离子探针(Mg2+,Ca2+,Pb2+,Hg2+,Ag+,Fe3+,Zn2+,Na+,Cr3+)、双光子阴离子探针(F-)、pH探针、双光子葡萄糖示踪器、双光子脂筏探针、双光子巯基探针、双光子半胱氨酸探针和双光子生物标记探针,以及双光子荧光探针在生物成像方面的应用,展望了双光子荧光探针的发展趋势与应用前景。

双光子荧光探针

荧光探针作为研究生物系统必不可少的工具,借助双光子显微成像可以直观便捷地对生物活性化合物或生物功能客体成分进行实时动态三维观测与监控。近十年来发展的双光子激发荧光探针,较单光子荧光探针具有显著的优点,如高分辨率、高清晰度、高灵敏度、无光漂白、无光致毒、定靶激发、高横向与纵向分辨率、低的生物组织吸光系数及低的组织自发荧光干扰等。本文综述了近七年来的双光子阳离子探针、双光子阴离子探针、双光子SO_2探针、双光子pH探针、双光子核酸探针、双光子半胱氨酸探针、双光子活性氧探针、双光子磷酸探针、双光子CO探针、双光子Alph-细胞探针、双光子CYP1A酶探针、双光子极性、黏度与温度探针的结构特性及其在生物成像方面的应用。双光子荧光探针已被广泛应用于临床诊断、疾病监测和药物筛选上,这推动了生物化学、医学和生命研究的发展。