实验性糖尿病大鼠肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及D双功能蛋白活性变化的初步研究

为研究过氧化物酶体脂肪酸β 氧化及 D 双功能蛋白在糖尿病脂代谢紊乱中所起的作用 ,分析了链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体数量和过氧化物酶体脂肪酸 β 氧化及D 双功能蛋白活性的改变 ,并用蛋白质印迹检测过氧化氢酶和D 双功能蛋白的表达量 .发现糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体增殖 ,过氧化氢酶蛋白量和酶活性显著增加 ,过氧化物酶体脂肪酸 β 氧化增强 ,D 双功能蛋白含量和酶活性显著降低 ,脂酰CoA氧化酶、L 3 羟脂酰CoA脱氢酶活性显著增加 .对过氧化物酶体脂肪酸 β 氧化增强和D 双功能蛋白活性降低与糖尿病脂代谢紊乱的关系进行了初步探讨 .

大鼠肝脏D-双功能蛋白活性增加与胆汁酸合成的关系

目的研究D-双功能蛋白(DBP)活性增加对胆汁酸合成的影响,从整体水平上探讨DBP在胆汁酸合成中的作用。方法将20只雄性Wistar大鼠随机分为邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)组(n=10)和对照组(n=10)。分别测定两组大鼠血清甘油三酯和总胆固醇的变化,肝脏过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)、DBP和胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)mRNA的变化,以及DBP活性和粪中胆汁酸含量。结果与对照组相比,DEHP组大鼠血清甘油三酯明显降低(P<0.01),肝脏PPARαmRNA表达明显增加(P<0.01)。在DBPmRNA表达及活性升高(P<0.01)的同时,CYP7A1mRNA表达加强,是对照组的1.6倍(P<0.01);粪中胆汁酸排出增加,是对照组的1.9倍(P<0.01)。DBPmRNA水平及其活性与CYP7A1mRNA水平均呈明显的正相关(r=0.89,P<0.01;r=0.95,P<0.01)。结论DBPmRNA表达及活性的升高,可引起CYP7A1表达及胆汁酸合成增加,DBP协同CYP7A1参与胆汁酸的生物合成。

大鼠胆汁酸合成加强时肝D-双功能蛋白mRNA表达及活性升高

目的通过研究胆汁酸合成代谢加强时D-双功能蛋白(DBP)表达及活性的变化,从整体水平上探讨DBP在胆汁酸合成中的作用。方法Wistar大鼠20只随机分为2组高胆固醇组和对照组。饲养2周后取材,测定血清总胆固醇、粪胆汁酸、肝胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)和DBPmRNA水平以及DBP活性。结果高胆固醇组血清总胆固醇含量升高,CYP7A1mRNA表达加强,粪中胆汁酸排出增加;同时,肝DBPmRNA表达及活性升高。结论大鼠胆汁酸合成加强时,肝DBPmRNA表达及活性升高,表明在整体水平上DBP可能参与了胆汁酸的合成。

胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性

目的:观察胆汁酸合成增多时,DBP的表达和活性的改变,从整体水平上探讨DBP在胆汁酸合成中的作用.方法:给C57BL/6J小鼠T0901317及给Wistar大鼠饲喂高胆固醇食物,两条途径激活肝X受体(LXR),上调CYP7A1的表达增加胆汁酸的合成后,用全自动生化分析仪测定粪胆汁酸,用RT-PCR的方法测定LXR的下游基因胆汁酸合成限速酶CYP7A1,以及DBP的mRNA水平;用Western Blot测定DBP的蛋白水平;用分光光度法测定DBP活性.结果:LXR被T0901317或高胆固醇食物激活后,CYP7A1的mRNA增加(P<0.05),导致粪中胆汁酸排出增加(P<0.05)的同时,小鼠、大鼠肝DBP的mRNA水平、催化活性以及小鼠的DBP蛋白水平也随之增加(P均小于0.05).结论:DBP在整体水平参与了胆汁酸合成并发挥重要作用.

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。

抗人红细胞-汉滩病毒核衣壳截短蛋白双功能蛋白的构建及表达

为了构建及表达抗人红细胞单链抗体 -汉滩病毒核衣壳截短抗原双功能蛋白 ,用于肾综合征出血热病人血清中抗HFRSV抗体的快速检测 ,我们将抗人红细胞的鼠单克隆抗体重、轻链可变区基因及汉滩病毒S基因片段N端部分基因克隆在同一个表达载体中 ,构建成分泌型双功能抗体表达载体pRBC -SN ,转化大肠杆菌XL -Blue,IPTG诱导表达。经ELISA测定 ,证明表达的双功能蛋白 ,具有抗人RBC和结合抗HFRSV抗体的双重功能。结果提示 ,表达的双功能蛋白具有双重活性 ,用于血清学快速检测 ,还需作进一步改构。

过氧化物酶体内的D-双功能蛋白质

D 双功能蛋白质是 1996年发现的哺乳动物过氧化物酶体内的一种酶 ,广泛分布于全身各组织 ,参与过氧化物酶体 β 氧化反应 ,特异地催化D 3 羟脂酰辅酶A的脱水与脱氢 ,在脂肪酸分解、胆汁酸合成等代谢中具有重要作用。D 双功能蛋白质缺陷病人通常在出生后 6月至 2岁之间死亡。

HSD17B4基因突变致D-双功能蛋白缺乏症

15 d男性患儿,因反复抽搐14 d入院。主要临床表现为难治性癫痫发作、反应差、喂养困难、四肢肌张力低、双侧听力受损,神经电生理表现为双侧脑干听觉诱发电位减弱及脑电图爆发-抑制图形,血清极长链脂肪酸提示二十六烷酸显著增高,基因检测提示HSD17B4基因c.101C>T(p.Ala34Val),c.14481460del(p.Ala483Aspfs*37)复合杂合突变。该文报道1例HSD17B4基因突变所致D-双功能蛋白缺乏症,对该病流行病学、临床特征及诊疗进行归纳总结,重点关注与大田原综合征的鉴别,为该病早期诊断提供了参考依据。

D-双功能蛋白在大鼠和裸鼠肝细胞癌生长中的作用

目的探讨肝细胞癌大鼠模型肝癌组织中D-双功能蛋白(DBP)的表达及DBP诱导裸鼠肿瘤生长情况。方法 22只雄性SD大鼠随机分为2组,正常对照组大鼠8只,腹腔注射2-乙基亚硝胺诱导肝细胞癌模型组大鼠14只,蛋白免疫印迹、免疫组化和逆转录聚合酶链反应检测DBP表达。14只雄性SPF级BALB/c-nu小鼠,随机分为2组,用空质粒和DBP过表达质粒分别转染HepG2细胞,将2组细胞分别注射于裸鼠皮下,空质粒对照组8只,DBP高表达组6只,检测2组裸鼠成瘤的大小。计量资料2组间比较采用t检验。结果肝细胞癌模型组大鼠肝癌组织中DBP的蛋白表达高于正常大鼠肝脏,差异具有统计学意义(1. 10±0. 35vs 0. 67±0. 12,t=-7. 48,P <0. 05);mRNA表达也高于正常大鼠肝脏,差异具有统计学意义(3. 70±0. 85 vs 1. 17±0. 72,t=-20. 46,P <0. 05)。DBP过表达组的裸鼠肿瘤体积显著大于空质粒组,差异具有统计学差异[(7590. 50±1867. 97) mm^3vs (1663. 78±420. 24)mm^3,t=-39. 78,P <0. 01]。结论高表达的DBP在大鼠肝癌的发展进程中发挥了促进作用,并且为肝癌的治疗和抑制药物的研发提供新的靶点。

维生素K2通过降低D-双功能蛋白活性抑制肝癌的实验研究

目的探讨维生素K2 (VK2)抑制D-双功能蛋白(DBP)诱导肝癌细胞增殖的机制。方法将HepG2细胞分为过表达DBP组(DBP组)和空载体质粒对照组(Empty组)及敲低DBP组(siDBP组)和对照小干扰RNA组(siNC组),DBP组和siDBP组分别给予0~100μmol/L不同浓度的维生素K2处理。用DBP过表达质粒和干扰RNA分别转染HepG2细胞,Western-blot检测DBP表达的变化;CCK-8分析检测细胞增殖能力;放射免疫分析测定雌二醇(E2)的水平。结果 DBP组HepG2细胞的增殖显著高于Empty组(1.76±0.22 1.83±0.27,P <0.05),siDBP组细胞增殖显著低于siNC组(1.84±0.25 vs.1.77±0.21,P <0.05),DBP组E2水平低于Empty组(20.76±3.42 vs.17.23±2.65,P<0.05);DBP组给予VK2处理后,HepG2细胞的增殖呈剂量依赖性降低(P<0.05),E2的水平也呈剂量依赖性增加(P<0.05);但VK2不影响DBP的表达。结论 VK2抑制由DBP过表达引起的肝癌细胞增殖的机制,为VK2作为治疗肝癌的辅助分子提供了新的理论基础和实验依据。

sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定。方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和W estern blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定。结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFNγ-重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性。结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础。

乳腺癌患者D-双功能蛋白表达与肿瘤标志物CEA和CA153关系的临床研究

目的探讨乳腺癌组织中D-双功能蛋白(DBP)表达及其与血清肿瘤标志物CEA、CA153水平的相关性,及对乳腺癌诊断和治疗的临床意义。方法选取2012年1月-2015年12月唐山市妇幼保健院住院的20例乳腺癌切除术患者作为试验组,同期20例健康体检的正常者作为健康对照组,应用化学发光法检查血清肿瘤标志物CEA和CA153的表达水平,免疫组织化学法检测乳腺癌组织和癌旁组织DBP的表达水平,分析比较其差异、相关性。结果试验组血清肿瘤标志物CEA、CA153水平均显著高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=39. 22、42. 87, P均<0.01),乳腺癌组织中DBP表达水平高于癌旁组织,乳腺癌组织DBP的灰度值为(96.3±11.4),癌旁组织为(29. 8±5.7),差异具有统计学意义(t=2.301,P<0.05)。试验组患者中,DBP的表达与血清CEA和CA153水平均呈正相关(r=0.800,P<0.01;r=0.709,P<0.01)。结论 DBP表达在乳腺癌的发展进程中具有重要的意义,并为乳腺癌的诊疗提供了一个新的研究靶点。

D-双功能蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及意义

目的检测子宫内膜癌组织中D-双功能蛋白(DBP)表达水平,及其与血清肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)检测结果的相关性,探讨DBP对子宫内膜癌诊断和治疗的临床意义。方法选取2013年1月～2015年12月在河北省唐山市妇幼保健院(以下简称"我院")进行子宫内膜癌切除术患者30例作为实验组,选取我院同期健康体检的正常者20名作为对照组,应用化学发光法检查血清肿瘤标志物CEA和CA125的表达水平,免疫组织化学法检测子宫内膜癌组织和癌旁组织DBP的表达水平,测量积分光密度值(IOD),采用Pearson相关分析法分析DBP与肿瘤标志物CEA、CA125的相关性。结果子宫内膜癌组织中DBP的IOD值表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P <0.05),且DBP与肿瘤标志物CEA(r=0.837,P <0.01)和CA125(r=0.787,P <0.01)的表达水平呈线性正相关。结论子宫内膜癌患者DBP的表达升高,并且与子宫内膜癌的发生发展密切相关。CEA、CA125和DBP联合检测对子宫内膜癌早期诊断有重要的意义,并为子宫内膜癌的治疗和预后提供了一个新的研究靶点。

维生素K2通过降低D-双功能蛋白活性抑制肝癌的实验分析

目的探讨分析维生素K2通过降低D-双功能蛋白(DBP)活性抑制肝癌的实验。方法把人源肝细胞Hep G2细胞分为过表达DBP组(A组)、空载体质粒对照组(B组)、敲低DBP组(C组)、对照小干扰RNA组(D组),A组和C组分别使用0~100μmol/L不同浓度的维生素K2进行处理。借助DBP过表达质粒、干扰RNA分别转染Hep G2细胞,经Western-blot进行DBP表达变化的检测,通过CCK进行细胞增殖能力的检测,经放射免疫进行雌二醇(E2)水平的测定。分析DBP表达对肝癌Hep G2细胞增殖、E2水平的影响;不同浓度维生素K2对肝癌细胞增殖、E2以及DBP表达产生的影响。结果A组Hep G2细胞增殖(1.89±0.28)明显高于B组的(1.74±0.19),D组(1.89±0.24)高于C组(1.73±0.19),差异具有统计学意义(P<0.05)。经Western实验,DBP过表达质粒、干扰RNA对Hep G2细胞进行转染以后,可对DBP表达进行干预。通过CCK-8实验发现,DBP过表达以及敲低可相应的增加或者减少细胞数量。A组E2水平(17.21±2.63)ng/ml低于B组的(20.77±3.41)ng/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。DBP过表达使细胞E2分泌水平下降。和B组相比较,A组Hep G2细胞增殖明显加强,在分别使用不同浓度的维生素K2处理2 d后,细胞增殖表现为依赖性下降;采用小干扰RNA敲低DBP的表达后,细胞增殖显著下降,但是维生素K2的处理对于其细胞增殖产生的影响不是很大。当维生素K2剂量不断上升时,培养基中E2水平也会相应上升;但是采用浓度100μmol/L维生素K2对B组、A组Hep G2细胞进行处理后,DBP蛋白表达变化不显著。结论维生素K2经降低DBP活性可抑制肝癌细胞,为疾病的治疗提供相关相应的参考依据,以确保治疗方案更为合理与科学。

发现靶向双功能蛋白的新型癌症治疗药物

近日,来自斯克里普斯研究所的研究人员通过研究鉴别出了一种名为GlyRS的特殊蛋白,这种蛋白会启动癌症的生长并且引发乳腺癌患者出现较高的死亡率.研究者发现,GlyRS可以围绕名为NEDD8的修饰蛋白产生一种防护屏障,同时还会产生一种安全的分子伴侣来对比其靶点蛋白cullin,在NEDD8存在的情况下,蛋白cullin就会被激活来降解p27.当p27保持在适当水平时。

近亲婚配所致D双功能蛋白缺乏症患儿1例的遗传学分析

目的分析1例由近亲婚配所致D双功能蛋白缺乏症(DBPD)患儿的遗传学病因。方法选取2022年1月6日因"肌张力低、全面发育落后"就诊于海南医学院第一附属医院的1例DBPD患儿作为研究对象,并收集其临床资料及其家系调查资料。提取患儿及父母、姐姐的外周血样,提取基因组DNA,应用全外显子组测序对患儿进行基因变异检测,对候选变异进行Sanger测序家系验证。应用生物信息软件预测变异位点的致病性,诊断患儿所患疾病。结果患儿为2岁9个月女性,临床表现为肌张力低下、发育迟缓、抬头不稳,感音神经性耳聋。血清长链脂肪酸增高,听性脑干诱发电位双侧耳90 dBnHL刺激均未能引出V波,头颅MRI提示胼胝体变薄,白质发育不良,患儿父母系近亲婚配,其长女表型正常,无D双功能蛋白缺乏症相关临床症状,其儿子出生当天频繁惊厥、肌张力低及喂养困难,生后1个半月夭折。基因测序结果显示患儿HSD17B4基因存在c.483G>T(p.Gln161His)纯合变异,父母、姐姐均携带HSD17B4基因c.483G>T(p.Gln161His)者。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异评级相关指南,c.483G>T(p.Gln161His)变异评级为致病性变异(PM1+PM2_Supporting+PP1+PP3+PP4)。结论父母近亲婚配导致患儿HSD17B4基因携带c.483G>T(p.Gln161His)纯合变异,考虑为是患儿的遗传学病因。

人肿瘤坏死因子与人γ干扰素重组双功能融合蛋白的研制

肿瘤坏死因子与γ干扰素具有非常相似的生物学活性,并在一些主要的生物活性方面表现有较强的协同作用。本文采用寡核苷酸指导下的定位缺失-插入体外基因突变技术,删除了干扰素与肿瘤坏死因子串联基因之间的非编码区,去徐了γ干扰素的翻译终止信号,插入了一个人工设计的连接肽,使γ干扰素与肿瘤坏死因子基因在不改变读码框架的条件下融合起来,并在大肠杆菌表达系统中表述了兼有γ干扰素和肿瘤坏死因子功能的融合蛋白。

HSD17B4新突变致过氧化物酶体D-双功能蛋白缺乏症一家系并文献复习

目的探讨HSD17B4突变相关的过氧化物酶体D-双功能蛋白缺乏症(PDBPD)的临床与基因特征。方法回顾性分析2020年8月南京医科大学附属儿童医院收治一家系2例HSD17B4突变致PDBPD的临床及基因情况。结果男性先证者及同胞姐姐均伴新生儿癫痫、精神运动发育障碍、共济失调、肌无力、听力损害、足部畸形,血清极长链脂肪酸正常,头颅磁共振成像(MRI)示双侧小脑半球萎缩,肌电图:多发性周围神经神经源性损害肌电改变,听觉诱发电位:重度双侧感音神经性听力损失。基因检测显示HSD17B4复合杂合突变(c.1171G>C,c.686-2A>T),临床确诊为PDBPD,年龄分别为8岁和14岁。结论报道2例HSD17B4突变致PDBPD,均符合典型临床表现。新发现HSD17B4基因c.1171G>C和c.686-2A>T突变,丰富了HSD17B4突变谱。

抗人红细胞单链抗体与狂犬病毒G蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

目的为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白。方法本研究利用特异性引物从重组质粒pMD-2E8scFv和pMD-G中以PCR方法扩增2E8基因(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和Kg基因(狂犬病毒G基因主要抗原表位区),采用重叠延伸(SOE)PCR法拼接成融合基因2E8Kg,构建原核表达质粒pET-Trx-2E8Kg并将其转化至BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达并对诱导菌液进行SDS-PAGE分析。结果 2E8Kg融合基因获得了高效表达并主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的23.5%左右,分子量约为77.7kD,与预期的大小一致。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达到98.9%。结论经Western-blot检测和红细胞凝集试验证明,2E8kg融合蛋白既能够与狂犬病毒(RV)高免血清发生特异性反应,又能够与人红细胞结合,具有双功能特性。

福氏痢疾杆菌组氨酸合成中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶双功能蛋白的初步研究

福志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌,是引起人类细菌性痢疾的主要致病源。以福志贺氏痢疾杆菌2a型301株全基因组为模板、以pET22b-(+)为载体、克隆了一个关键基因:组氨酸合成途径中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶蛋白(简称:sf2088)。以BL21(DE3)为表达菌株,优化表达条件,获得了可溶表达的蛋白。经过亲和层析和分子筛层析获得目标蛋白。采用分析超速离心和动态光散射实验,对纯化后的蛋白进行稳定聚集状态的条件搜索,结果发现锌离子对稳定其聚合状态很重要。通过正交实验,获得蛋白保持稳定聚集态的条件。这对该酶的进一步研究奠定了基础。