萘降解菌N19-3的分离、鉴定和萘双加氧酶基因的检测

从石油污染土壤中分离到一株高效降解萘的N19-3菌株.经形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析等鉴定其为丛毛单胞菌属（Comamonassp.）.该菌株能在30℃,30 h内将1 000 mg/L的萘完全降解.降解萘的适宜温度为20-30℃,适宜pH为7.0-9.0.0.1 mmol/L的Ca^2＋和Fe^3＋对N19^-3菌株降解萘有较强的促进作用,0.1 mmol/L的Mn^2＋和Zn^2＋对N19-3菌株的生长和萘的降解也有一定的促进作用,而0.1 mmol/L的Cu2＋则完全抑制了N19-3菌株的生长和萘的降解.通过PCR方法在N19-3菌株中扩增出分别与C.testosteroniH菌株的萘双加氧酶铁硫蛋白大亚基基因（pahAc）与双加氧酶铁硫蛋白小亚基基因（pahAd）高度同源的核苷酸片断.

焦化废水活性污泥PAH双加氧酶基因多样性分析

为分析焦化废水活性污泥中降解PAH双加氧酶的多样性,利用16Sr DNA-PCR-DGGE方法,以实际焦化废水好氧单元活性污泥总DNA为模板,通过引物对污泥中的双加氧酶基因进行了克隆表达和多样性分析.结果表明,以活性污泥总DNA为模板,利用引物RHD-GN-610F和RHD-GN-916R扩增后有明显的产物,产物大小约为300bp;DGGE指纹图谱显示PCR产物有8条分离条带,丰度分别为2.99%、8.16%、20.75%、28.50%、8.62%、7.26%、10.62%和13.10%;条带经切胶回收PCR扩增后出现明显的扩增产物,TA克隆后成功测试出4条序列,长度分别为305bp,298bp,334bp和294bp,表明焦化废水活性污泥中存在不同降解PAH的RHD酶.这些结果为焦化废水中PAHs的风险评估及其潛在生物降解提供理论基础.

降解2,4-二氯酚的假单胞菌GT241-1的特性及其3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因定位

从 2 ,4 -二氯酚生产厂排污口污泥中分离并筛选到一株降解 2 ,4 -二氯酚的细菌 GT2 4 1- 1,经鉴定属假单胞菌属 .菌株 GT2 4 1- 1能在 4 8h内将 90 mg/ L的 2 ,4 -二氯酚降解 91% . GC/ MS分析表明 ,该菌株能将 2 ,4 -二氯酚彻底降解而不积累中间代谢产物 .经 38℃热处理 ,菌株 GT2 4 1- 1中有 1.9%丧失了 2 ,4 -二氯酚降解能力 .菌株 GT2 4 1- 1有两条大质粒带 .Southern杂交表明 ,菌株 GT2 4 1- 1的 3,5-二氯儿茶酚 1,2 -双加氧酶基因定位于约 11kb的 Eco RI/ Xba

万寿菊类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1克隆与表达分析

【目的】克隆万寿菊(Tagetes erecta L.‘Scarletade’)类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1(TeCCD1),分析其序列特征和表达特性,为阐明其在类胡萝卜素降解途径中生物学功能及进一步探讨万寿菊花色形成机理提供理论基础。【方法】依据万寿菊花蕾转录组数据,利用同源序列比对结果设计引物,结合RT-PCR技术克隆获得万寿菊CCD1 cDNA全长,分析其序列特征;利用Real-time PCR分析舌状花未开花蕾、半开花蕾、开放的头状花序和完全开放的头状花序4个不同发育时期的基因表达特性。【结果】克隆获得万寿菊CCD1(Gen Bank登录号:KX557488)的cDNA全长序列为1 746 bp,编码区长度1 626 bp,编码541个氨基酸。蛋白质分析表明TeCCD1为不稳定蛋白,不含信号肽,属RPE65超家族(登录号:PF03055),包含CCD家族保守结构域,主要定位于细胞质。万寿菊CCD1核酸序列与除虫菊CCD1同源性最高,为89%;氨基酸序列分析表明万寿菊CCD1与除虫菊CCD1同源性高达93%,与其他19个不同种属的CCD1同源性在75%—83%,说明TeCCD1是高度保守的基因;系统进化树分析显示TeCCD1的进化基本符合植物分类学的进化规律,并具有明显的种属特征,万寿菊与菊科同源基因亲缘关系最近。Real-time PCR分析表明TeCCD1在舌状花发育过程中均有表达,随舌状花的开放逐渐升高,S4期达到最大值。【结论】克隆获得万寿菊舌状花的CCD1,是典型的CCD家族成员,为高度保守的基因,主要定位于细胞质,万寿菊舌状花颜色变浅可能与CCD1表达量增加导致类胡萝卜素降解有关。

假单胞菌的氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因的克隆和表达

从土壤中分离得到1株降解2,4-二氯酚(2,4-DCP)能力较强的细菌菌株GT241-1,克隆了该菌株的3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因(dcpB),采用的克隆策略为:用Southern杂交对dcpB进行定位后,构建重组质粒,再用斑点杂交从重组质粒中筛选目的转化子.经序列测定得知dcpB亚克隆片段全长4303bp,其中dcpB基因编码区765bp.核苷酸和推测的氨基酸序列分析表明,dcpB与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.dcpB基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶.

萘和苯酚降解菌中儿茶酚2,3-双加氧酶基因的类似性分析及杂种酶构建

从7个萘降解菌株和5个苯酚降解菌株中经PCR扩增得到12个儿茶酚2,3-双加氧酶(C23O)基因,大小均为924bp.根据DNA序列的类似性,可将这12个C23O基因聚类为3组,此结果与分离菌株的样本来源基本一致.这12个基因均编码307个氨基酸残基的儿茶酚2,3-双加氧酶,序列中都含有9个严格保守的氨基酸残基(Gly30、His153、Leu172、His199、His214、His246、Tyr255、Pro259、Glu265),均属于外切双加氧酶的I.2.A亚家族.通过盒式PCR,用各种萘和苯酚降解菌的C23O基因中心区替换恶臭假单胞菌ND6菌株pND6-1质粒中nahH基因的中心区,得到5个杂种C23O基因,这些基因在pET-E.coli BL21(DE3)系统中表达以后,均能检测到C23O活性,其中中心区来自假单胞菌ND24菌株C23O基因的杂种酶C23O-ND24,其比活力高于对照恶臭假单胞菌ND6菌株的野生型C23O.

儿茶酚双加氧酶基因大肠杆菌表达体系研究

从恶臭假单孢菌 (Pseudomonassp .S 47)的DNA中扩增得到 92 4bp编码儿茶酚双加氧酶的基因片段 ,将其构建入 pBluescriptSK载体 BamHI和 SacI位点间。测序结果显示与Kim ( 2 0 0 0 )报道一致。将该基因插入带庆大霉素抗性基因启动子和t1t2终止子载体pG2 5 1、分别带ompA和EAP信号肽、lpp和Gmr 启动子载体 pYF3 95和 pYF5 2 5 4中 ,构建组成型表达载体pG2 5 1,分泌型表达载体 pYFX1,pYFX2。酶活测定结果显示pG2 5 1为 665mu/mL ,pYFX1,pYFX2分别为 1815mu/mL ,10 15mu/mL。SDS PAGE电泳显示表达蛋白产物的分子量约为 3 5kD。分泌型表达载体pYFX1表达量大于 pYFX2 ,组成型表达载体

少动鞘氨醇单胞菌ZX4儿茶酚2，3-双加氧酶基因的克隆与表达

应用PCR方法克隆了少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ZX4菌株的儿茶酚2,3-双加氧酶基因(c230-ZX4)。核苷酸序列测定与分析表明,该基因片段全长924 bp且具有一个完整的阅读框,编码306个氨基酸残基。该基因与已报道的来自菌株S.yanoikuyae B1和Sphingomonas sp.KMG425的xylE基因(编码产物均为C230)具有较高的核酸序列同源性,分别为94.37%和94.05%。通过HindⅢ和XhoⅠ两个限制性酶切位点将该基因连接到质粒pET30(a)+上得到重组表达质粒pET-S3,并在E.coli BL21进行了表达,得到了42.3 kD的融合蛋白。酶活测定发现该基因工程菌株的发酵产酶活力明显高于出发菌株。

不同细菌中邻苯二酚2，3-双加氧酶基因的研究

芳烃类化合物是较强的致癌物质之一，对人体危害极大。邻苯二酚是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。邻苯二酚2，3-双加氧酶(CatO2 ase)也叫变儿茶酚酶(MPC)，存在于一些能分解芳香族化合物的细菌中，它能催化苯环的邻位裂解，将无色或微棕色的邻苯二酚转变成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS)，

类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4调控芹菜不同组织的着色

【目的】研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4在不同颜色芹菜中的基因型及相对表达量,结合类胡萝卜素含量测定,分析AgCCD4对芹菜组织中类胡萝卜素积累的影响,为进一步研究CCD亚家族基因在不同颜色芹菜组织着色中的作用奠定基础。【方法】采用同源比对法检索芹菜基因组中的CCD家族基因AgCCD4。从‘津南实芹’‘黄太极’‘紫杆一号’和‘赛雪’4种不同颜色芹菜中分别克隆获得芹菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4。对芹菜AgCCD4的蛋白氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等进行分析,预测其保守结构域和二级结构以及建立三级结构模型。采用荧光定量PCR技术检测AgCCD4在不同颜色芹菜不同组织中的表达水平。采用超高效液相色谱(UPLC)对4种颜色芹菜的叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定。采用农杆菌介导的瞬时表达转化法,研究AgCCD4蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。【结果】序列分析结果表明AgCCD4包含1个长度为1779 bp的开放阅读框(ORF),编码592个氨基酸。‘赛雪’中AgCCD4的核苷酸序列与其他品种相比存在18个碱基和9个氨基酸位点的差异,蛋白质相对分子质量分别为65.07 kD和65.12 kD,等电点分别为6.03和5.95。进化树分析表明,芹菜AgCCD4与菊科的向日葵和莴苣CCD4进化关系较近。AgCCD4蛋白的二级结构中包含多个α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要以β-折叠为主。亚细胞定位分析表明AgCCD4是一个定位在叶绿体上的蛋白。对4种颜色芹菜叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定,结果显示芹菜根中均未检测到叶黄素和β-胡萝卜素,叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量均以‘津南实芹’最高,分别为1102.58μg·g^(-1) DW和241.92μg·g^(-1)DW,‘紫杆一号’最低,分别为57.12μg·g^(-1) DW和45.65μg·g^(-1) DW。在叶柄中,仅在‘黄太极’中检测到β-胡萝卜素,叶黄素也只在‘津南实芹’和‘黄太极’中被检测到。荧光定量PCR结果显示,AgCCD4在芹菜叶片中表达量最高,在根中最低。‘紫杆一号’和‘赛雪’叶片中AgCCD4的相对表达量相似,都显著高于‘津南实芹’和‘黄太极’。【结论】本研究从4种颜色芹菜中分别克隆得到AgCCD4,其中‘赛雪’的基因序列和其他品种存在差异,其蛋白均含有RPE65保守结构域。AgCCD4表达量在芹菜不同组织中具有显著差异。芹菜中AgCCD4表达量与类胡萝卜素含量呈负相关。植物体中类胡萝卜素的含量和种类影响植株的颜色变化,AgCCD4可能通过降解类胡萝卜素来调控芹菜组织着色。

苯胺双加氧酶基因的克隆与序列分析

通过设计苯胺双加氧酶基因特异引物,以苯胺降解菌株ANA5基因组DNA为模板,PCR扩增出目的基因片断。然后利用粘粒pLAFR3作为载体,以E.coliEPI100作为受体,构建了菌株ANA5的基因组粘粒文库。以PCR扩增产物作为探针,通过菌落原位杂交筛选得到两个阳性克隆,经Southern杂交及亚克隆测序分析,初步确认克隆到苯胺双加氧酶基因。同时完成了苯胺双加氧酶基因atdA3A4A5序列的测定,并对其核苷酸及其推导的氨基酸序列进行分析,结果表明克隆到的苯胺双加氧酶基因与GenBank报道的基因有一定的差异,同时体现了该基因在进化上的保守性。

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体。方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上。BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1 301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105中。结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1300bpDNA片段。结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化。

新疆准东油田石油污染土壤萘双加氧酶基因的多态性

为了分析新疆准东油田石油污染土壤中萘双加氧酶功能基因的多态性,采用无机盐培养基,以萘为唯一的碳源物质,对准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,简称HPLC)对降解产物进行检测,同时采用萘双加氧酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。高效液相色谱检测结果显示,萘被降解成小分子产物,证明液体培养基均富集培养获得了萘降解菌群。从准东油田共分离得到了49条萘双加氧酶基因片段,共编码35条氨基酸序列,GenBank登录号为KY304781~KY304829。获得的萘双加氧酶基因系统发育树结果显示,研究获得的萘双加氧酶基因分为4个类群。通过高效液相色谱分析及萘双加氧酶基因的分子检测,证明准东油田石油污染土壤中含有萘降解菌株,这些萘降解菌株是可以通过液体富集培养获得的,并且可以通过固体平板获得降解萘的单菌株。

准东油田萘降解菌群培养及菌群双加氧酶基因多态性分析

采用无机盐培养基,以萘为惟一的碳源物质对准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养。经过5次培养后,利用固体平板对获得菌群萘降解能力进行检测,同时利用HPLC对降解产物进行检测。离心收集富集培养基中的菌体,提取基因组DNA,基于Illumina Miseq测序平台对16S r RNA序列进行测序及生物信息学分析,同时采用萘双加酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。结果表明,含有萘的固体平板有清晰透明斑的出现;高效液相检测结果显示,萘被降解成小分子产物,证明液体培养基可富集培养获得萘降解菌群。萘降解菌群16S r RNA测序比对结果显示,富集培养获得菌群分属于5门9纲15目24科31属,共33种细菌。另外共获得萘双加氧酶基因片段11条,GenBank注册号为KY304819-KY304829。系统发育树结果显示,所获萘双加氧酶基因分为4个类群。通过HPLC及双加氧酶基因的分子检测,验证已从准东油田石油污染土壤当中富集培养获得萘降解菌群。

1,2,4-三氯苯双加氧酶和脱氢酶基因克隆与序列分析

通过Pseudomonas nitroreducensJ5-1对不同氯苯类底物的降解实验,发现其降解能力大小顺序为：1,2,4-三氯苯〉1,3-二氯苯〉1,2-二氯苯〉氯苯,与已报道的1,2,4-三氯苯降解菌株在底物利用的特性方面存在差异.采用PCR技术从J5-1中扩增获得氯苯降解过程中的关键酶——氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列,分别命名为tcbA和tcbB,序列比对发现其与Burkholderia sp.PS12的氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列同源性最高.通过J5-1的氯苯双加氧酶α亚基（TcbAa）与PS12的氯苯双加氧酶α亚基（TecA1）的氨基酸序列比对发现,在307-310位置有连续4个氨基酸残基的差异（I307L、M308TI、309V、Q310E）,这可能是造成2株菌对1,2,4,5-四氯苯降解偏好性差异的原因.此外,通过催化芳香化合物降解的双加氧酶α亚基的系统进化分析,认为TcbAa属于甲苯/联苯亚科,且与多取代氯苯双加氧酶α亚基的同源性最大.

节杆菌PJ3基因组中发现2,3-二羟基联苯双加氧酶基因

从污水中分离出一株以咔唑为惟一碳源和氮源生长的菌株PJ3,用16S rDNA鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp),构建了PJ3菌株基因组文库并获得一株阳性克隆JM109(pUCW402).通过GenSCAN软件和BLAST分析发现,在插入pUCW402的外源片段(3360bp)中存在一个由933bp片段编码的2,3-二羟基联苯双加氧酶基因.进化分析表明,从PJ3来源的2,3-二羟基联苯双加氧酶在进化树上形成一个独立的分支.Southern杂交进一步证实,编码该酶的基因定位于节杆菌PJ3的基因组DNA上.为了鉴定该基因的生物学功能,构建了BL21(pETW-8)重组菌株.与菌株JM109(pUCW402)和PJ3相比,2,3-二羟基联苯双加氧酶的表达水平在BL21(pETW-8)中最高.酶活分析表明,2,3-二羟基联苯双加氧酶不具有绝对专一性,对2,3-二羟基联苯的催化能力高于邻苯二酚.因此推测PJ3菌株对芳香族化合物降解过程中,2,3-二羟基联苯双加氧酶主要负责催化双环化合物的降解.

长筒石蒜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LlCCD4的克隆与表达

长筒石蒜(Lycoris longituba)是石蒜属植物,为中国特有的观赏花卉,具有极高的观赏价值也是石蒜属少有的香花品种,然而目前尚未有关于其花香方面的报道。故本研究以长筒石蒜花瓣为材料,在长筒石蒜中开展了花香基因CCD4的研究。利用课题组已获得的长筒石蒜花瓣转录组数据库,我们筛选到1个与拟南芥CCD4基因同源性最高的序列,并克隆得到了其完整的编码区,命名为LlCCD4。该基因编码区全长为1 815 bp,编码604 aa,蛋白质分子量约为66.20 kD,理论等电点为6.43,属于酸性不稳定的疏水性蛋白,且具有CCD4基因共有的保守结构域。进化分析进一步表明该基因为CCDs基因家族中的CCD4成员,与单子叶植物番红花中的CCD4基因具有较高的同源性。实时荧光定量分析证实该基因在长筒石蒜的盛花期即长筒石蒜花瓣最香的时期表达量最高。本研究将有助于揭示长筒石蒜花香形成的分子机理,并为石蒜属植物花香改良提供基因资源。

2-氧化戊二酸依赖的双加氧酶基因F6’H1促进拟南芥叶片衰老

拟南芥2-氧化戊二酸依赖的双加氧酶基因F6’H1缺失突变体f6’h1出现叶片衰老延迟表型。利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,再以抗性筛选方法获得了F6’H1基因诱导过量表达拟南芥植株,地塞米松(DEX)喷施处理24 h能显著诱导F6’H1基因上调表达,F6’H1基因的过量表达使转基因拟南芥叶片衰老提前。结果表明,拟南芥2-氧化戊二酸依赖的双加氧酶基因F6’H1正向调控叶片衰老。

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)在拟南芥中表达的初步研究

将从一株邻单胞菌中克隆到的一个新的邻苯二酚 1,2 双加氧酶基因 (tfdC)的起始密码子由GTG突变成ATG ,并克隆到农杆菌双元载体 pPZPY12 2中 ,利用农杆菌介导转化模式植物拟南芥 ,获得了转化植株 .经过PCR ,PCR Southern和Southerndotblot方法检测证实 ,tfdC基因已经整合到拟南芥基因组中 .邻苯二酚 1,2 双加氧酶酶活性检测表明 ,转基因植株具有一定的酶活性 。

邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达

为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌,利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆,并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接,得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下,经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中,最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下,菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg?L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37℃、最适pH为7.5。在此条件下,工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05),降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。