双向启动子构建及在毛白杨中瞬时表达研究

该研究通过PCR扩增、酶切及连接等分子生物学研究方法分别将β-葡萄糖苷酶基因（gus A）和绿色荧光蛋白基因（gfp）与双向启动子两端融合，构建成双可视报告基因融合双向启动子的植物二元表达载体pBDGG．通过农杆菌介导的叶盘法转化毛白杨叶片以鉴定所构建的双向启动子的功能．对农杆菌侵染3～4d的毛白杨同一叶片进行GUS组织化学染色检测和紫外激发后通过荧光显微镜观测绿色荧光，结果表明gusA基因和疥基因都能够进行瞬时表达，表明该双向启动子可在毛白杨中实现双向表达．该文还讨论了双向启动子在植物基因工程中应用的可能性。为实现植物基因工程的“一箭双星”（即一个启动子同时双向表诀两个或名个基丙）奠定基础．

马立克氏病病毒pp38基因上游的一个双向启动子研究

马立克氏病病毒 (MDV)pp38基因上游是病毒基因组DNA复制原点。在其两侧均含有启动子TATA box、CAAT box等特征性的保守基元 ,推测是一个天然的双向启动子。为了在体外验证其双向启动活性 ,本研究以MD Vpp38为报告基因 ,并将其ORF插入到pUC18中 ,构建了pUC pp38质粒。将包含该启动子完整区域的 789bp序列分别以正反两个方向克隆进pUC pp38质粒中pp38报告基因的上游 ,获得的重组质粒pProfpp38和pProrpp38。将所获得的重组质粒分别转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过间接免疫荧光试验检测pp38基因的表达以验证该启动子的双向启动活性。结果表明 ,马立克氏病病毒复制原点区的启动子无论以何种方向插入pUC pp38质粒中 ,在转染细胞2 4h内能检测到pp38基因的表达 ,4 8h后能获得高效和持续的表达。逐渐缩小该启动子的范围 ,最终在 32 0bp时 ,仍能检测到两个方向较强的启动活性。

应用双向启动子RNA干扰技术抑制ICOS表达

目的应用双向启动子技术构建针对共刺激分子ICOS的逆转录病毒干扰载体,观察其对ICOS表达的影响。方法设计ICOS的干扰序列,构建基于双向启动子的逆转录病毒干扰载体MIW-ICOS,包装病毒后转染Hut78细胞,RT-PCR检测ICOS转录水平水平受抑制情况,FACS检测细胞表面ICOS蛋白表达受抑制情况。结果构建了针对ICOS三段序列的逆转录病毒干扰载体MIW-ICOS,并证实其中的一个干扰载体能有效抑制ICOS的表达。结论基于双向启动子的编号为245的ICOS逆转录病毒干扰载体能有效抑制Hut78 T细胞上ICOS的表达,为干预ICOS-ICOSL共刺激通路提供了有效手段。

顶头孢霉pcbAB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用

用PCR方法从丝状真菌顶头孢霉中克隆出全长 1 3kb的pcbAB_pcbC双向启动子DNA片段 ,通过转化子对博莱霉素的抗性证明了该启动子在顶头孢霉中的双向启动功能。另外 ,利用所克隆的pcbAB_pcbC双向启动子构建了一个用于顶头孢霉转化的质粒pYG13,并成功地将该质粒转化入顶头孢霉。pYG13含有博莱霉素抗性基因和透明颤菌血红蛋白基因 (vgb) ,Southern杂交和CO结合实验分析显示vgb整合到顶头孢霉的基因组DNA中并表达了有活性的透明颤菌血红蛋白。

真核生物双向启动子的结构与功能

双向启动子(bidirectional promoter)是指位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列.双向启动子的双向转录机制可能是两个RNA聚合酶同时聚集在无核小体区的边界,然后在两个方向上起始转录.双向启动子在真核生物基因组中广泛分布,大多数的双向启动子缺少TATA盒,而具有较高的GC含量和丰富的CpG岛.本文概述了双向启动子双向起始转录的最新研究,并对其在双向转录基因对共表达和稳定性表达调控中的作用及其应用做了详细阐述.

山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定

为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。

汉字双向启动效应的实验研究

以五类高、中、低频汉字为材料．用词汇决定任务与诵读回忆任务间的相互启动方法，对汉字启动效应进行了初步探讨。结果发现，形与音都具有启动作用；低频字表现出受到或产生更大的抑制性启动作用；对于真伪识别任务，则诵读回忆任务中与其字形相似的字产生的启动效果更大；对于诵读回忆任务，则真伪识别任务中与其字音相似的字产生的启动效果更大．结果表明，字形与字音启动作用的大小取决于目标字加工中二者相对作用的大小。

马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究

从马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区某一点,将介于MDVpp38基因和1 8kb转录子之间的双向启动子分割成两个单方向的启动子。以pp38为报告基因,pUC18质粒为载体,构建了含不同方向完整启动子序列的pProfpp38和pProrpp38质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfpp38和pdProrpp38质粒。4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞(Chickenembryofibroblast,CEF)后,均能检测到pp38基因的表达。进一步以氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyltransferase,CAT)为报告基因,构建了含不同方向完整双向启动子的pProfCAT和pProrCAT质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfCAT和pdProrCAT质粒。通过转染试验,定量分析了完整启动子和分割后启动子在两个方向上的启动活性。实验结果表明,分割后的启动子在两个方向上的启动活性均比相应方向上完整启动子的活性低,其中1 8kb转录子方向上的活性下降了4

水稻胚乳特异型双向启动子的克隆及功能鉴定

以水稻中的1对双向转录基因(TIGR Locus:LOC_Os09g39540和LOC_Os09g39550)的翻译起始位点之间的序列作为研究对象,克隆其序列并进行功能鉴定。以明恢63基因组DNA为模板,采用PCR法扩增该序列(命名为BDP1),以正反两个方向插入启动子功能分析载体pDX2181,分别命名为BDP11和BDP12;转基因阳性植株的GUS组织化学染色结果证明该启动子为胚乳特异型的双向启动子,两端的表达水平均很低。将启动子片段距离转录起始位点较短的一端向下游延伸123bp(命名为BDP2),以正反两个方向插入启动子功能分析载体pDX2181,分别命名为BDP21和BDP22;转基因阳性植株的GUS组织化学染色结果显示该启动子的胚乳特异型双向表达模式维持不变,表达水平高于BDP1。

烟草黄矮双生病毒中双向启动子的活性及其调节控制

将烟草黄矮双生病毒（Ｔｏｂａｃｏｙｅｌｏｗｄｗａｒｆｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ，简称ＴｏｂＹＤＶ）中双向启动子的区域，以不同长度的片段和方向插入启动子分析载体ｐＧ１，与ＧＵＳ报道基因和ＮＯＳ终止子融合。同时，将各个ＴｏｂＹＤＶ读码框区域插入表达载体ｐＡＲＴ７中，置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和ＯＣＳ终止子之间。用电穿孔法将各种启动子构建物个别地或者与读码框构建物成对地导入烟草和玉米原生质体，以考察ＴｏｂＹＤＶ启动子控制下ＧＵＳ基因瞬间表达的活性，以及ＴｏｂＹＤＶ的读码框编码产物对启动子活性的调控作用。结果表明，在烟草原生质体中，Ｃ１＋２基因的启动子活性最强，并受到Ｃ１＋２读码框编码产物的抑制；而Ｖ１和Ｖ２读码框的启动子活性较弱，然而它为Ｃ１＋２和Ｖ２，Ｖ２读码框构建物编码产物增强。在玉米原生质体中，与Ｖ１和Ｖ２基因的启动子相比。

应用双向启动子RNA干扰技术抑制大鼠血管平滑肌细胞MAPK的表达

目的应用双向启动子技术构建针对MAPK的干扰载体,观察其对MAPK表达的影响。方法设计MAPK的干扰序列,构建基于双向启动子的干扰载体pHippy-MAPK,RT-PCR检测大鼠血管平滑肌细胞MAPK转录水平受抑制情况,免疫印迹检测大鼠血管平滑肌细胞MAPK蛋白表达受抑制情况,3H-TdR掺入法检测大鼠血管平滑肌细胞的增殖,免疫沉淀法检测大鼠血管平滑肌细胞MAPK活性。结果构建了针对大鼠MAPK3段序列的干扰载体pHippy-MAPK,并证实其中的1个干扰载体pHippy-MAPK3能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞MAPK的表达。结论基于双向启动子的编号为3的pHippy-MAPK干扰载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞MAPK的表达,为干预MAPK信号途径通路提供了有效手段。

双向启动子的分离及嵌合基因拼接的优化研究

从带有 pTi15955 TR-DNA 片段的克隆 pAR17出发,经一系列 DNA 重组步骤,我们分离到了—490bp 的双向启动子 DNA 片段。DNA 顺序分析表明,与 pTiAch5一样,pTi15955TR-DNA 的基因1′和基因2′启动子皆具典型的 TATA 盒,它位于起始密码上游90bp 处,但基因1′和2′皆无典型的 CAAT 盒。转录起始可能在基因1′和2′的起始密码上游60bp 处。为了研究嵌合基因5′端启动子的优化拼接以及3′末端结构方向对嵌合基因表达的影响,我们对分离的双向启动子2′进行了改造,将 BamHI 酶切位点移到了起始密码 ATG 处,并构建了三种萤光素酶嵌合基因,经植物基因工程载体 pGV3850,分别将这三种嵌合基因引入了烟草,结果表明,经改造的双向启动子2′要比未改造的强,胭脂碱合成酶基因3′末端当以反向与萤光素酶结构基因相拼时大大降低其基因在转化烟草中的表达。

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性. TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.

野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析

【目的】研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’(Vitis quinquangularis‘Danfeng-2’)芪合成酶(stilbene synthase)基因双向启动子的启动活性与差异。【方法】通过染色体步移技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子,并与Uid A基因(β-葡萄糖苷酶基因,GUS)融合,利用真空渗透法在葡萄叶片中瞬时表达,组织化学染色和GUS蛋白定量法分别检测白粉菌接种、温度处理、茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸处理对双向启动子活性的影响。以毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲葡萄‘赤霞珠’不同成熟时期果实的c DNA为模板,通过荧光实时定量PCR的方法分析Vq STS12/Vv STS31和Vq STS33/Vv STS32的表达情况。【结果】Pvq DSTS12受到白粉菌、茉莉酸甲酯、高温和低温的诱导后,启动活性增强,对水杨酸和脱落酸处理不敏感;Pvq DSTS33在茉莉酸甲酯处理下启动活性增强,在高温和低温的处理下启动活性降低,对水杨酸、脱落酸和白粉病处理不敏感。荧光实时定量PCR结果显示,在果实发育的6个时期中,‘丹凤-2’Vq STS12和Vq STS33的表达量均高于‘赤霞珠’Vv STS31和Vv STS32。4个基因的基本表达趋势为:浆果转色期之前持续增长,转色后期下降,浆果半熟期达到最高峰,浆果成熟期表达降低。其中毛葡萄‘丹凤-2’Vq STS12的表达量在转色后期并未降低且增加到上一时期的2.3倍;欧洲葡萄Vv STS32基因在成熟期表达量升高为前一时期的1.42倍。【结论】双向启动子活性的研究为利用植物天然双向启动子提供依据。

基于表观遗传学探索玉米双向启动子对转录的影响

为了探索玉米中表观遗传修饰对双向启动子及相关基因表达的调控作用,本研究通过整合公共数据平台中表观基因组和转录组数据,对易接近染色质区域(Accessible chromatin regions, ACRs)和组蛋白修饰进行分析并探索其对玉米双向启动子(Bidirectional promoter, BDP)及相关基因的影响。结果发现,ACRs与转录起始位点(Transcription start site, TSS)之间的距离能够影响相应基因的表达水平:ACRs距离TSS越近,基因表达水平越高;ACRs距离TSS越远,基因表达水平越低。ACRs的分布位置在基因对的共同表达过程中起着重要的作用,这可能是通过编排BDPs周围的组蛋白修饰和开放染色质区域转录因子的结合来调节转录的。染色质结构的动态变化,ACRs和组蛋白修饰的共同作用,在调控基因组中具有BDPs的基因对及其共表达方面起着重要的作用。因此,本研究的发现可能有助于增进对ACRs和组蛋白修饰调控相关基因对转录过程的理解,为进一步探索双向启动子在玉米分子育种的功能奠定理论基础。

双向启动子遗传调控位点研究

人类基因组中存在"头对头"方式的基因对,两个基因5’端相邻并分别位于DNA的正负两条链上,其转录起始位点之间的距离不大于1 000bp。一般认为"头对头"基因对可能共享同一个启动子,即"双向启动子"。通过鉴定出1 190对"头对头"基因对,表达相似性结果显示比随机情况更倾向于共表达。"头对头"基因对的遗传调控位点研究显示,SNPs对"头对头"基因对存在不同的调控模式,有助于进一步理解双向启动子的调控机制,为进一步了解人类基因转录调控机制提供帮助。

双向启动反接制动控制线路的PLC程序设计

双向启动反接制动控制线路在电力拖动控系统中具有重要作用,双向启动反接制动控制线路复杂。分析PLC改造,有效克服传统机电控制模式的系统响应时间长、可靠性差的局限性。

用数据传送指令编辑双向启动反接制动程序的技能训练教学

双向启动反接制动是一种比较完善的控制线路,应用于铣床、镗床、中型车床等主轴的制动控制,所用电器较多,线路比较繁杂,维修困难。可编程控制器简称PLC,具有可靠性高、控制功能强、组成灵活和操作方便等特点。使用PLC控制,可以满足现代工业生产的优质、高产、节能与降低成本的需要。本文以双向启动反接制动为例,借助德国西门子公司生产的S7—200系列PLC平台,开展PLC技能训练教学,使学生巩固PLC编程的基本知识,掌握编程要领和编辑梯形图的基本方法。