2型猪链球菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

为改进适用于2型猪链球菌分泌组双向电泳样品的制备方法,本研究将无蛋白细菌培养液培养2型猪链球菌,分别以超滤-冻干法、超滤-冻干-丙酮沉淀法和改良超滤-冻干-三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法富集培养物上清中的细菌分泌蛋白质,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明改良浓缩-冻干-TCA/丙酮沉淀法较为理想,蛋白丢失少、溶解性佳,所得双向电泳图谱清晰,分辨率高。因此,改良浓缩-冻干-TCA/丙酮沉淀法更适用于制备体外培养的2型猪链球菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。

2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的双向电泳图谱比较分析

利用双向电泳技术可以对体外培养的2型猪链球菌强毒株和无毒株进行胞外蛋白质组比较,寻找与毒力相关的蛋白质。2型猪链球菌强毒株和无毒株在无蛋白细菌培养液中37℃摇床培养16h,从培养物上清中获得胞外蛋白。第一向电泳用pH4-7线性IPG胶条进行等电聚焦,第二向电泳用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白,经过考马斯亮蓝R350染色,图像扫描后,利用软件分析处理图像。在2型猪链球菌强毒株和无毒株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白质斑点,它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到的差异蛋白质斑点中,其中有50个蛋白斑点只存在于无毒株中而强毒株中不存在,有52个蛋白斑点只存在于强毒株中而无毒株中不存在,有7个蛋白斑点的表达量相差达5倍以上。这为研究2型猪链球菌的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息。

异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc^2 155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

目的利用蛋白质组学方法,识别异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞(SM细胞)后差异表达的蛋白质,为进一步深入探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。方法观察不同浓度的异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌生长曲线,确定药物处理SM细胞的最佳时间和浓度,并提取在最佳处理时间和浓度条件下的SM细胞总蛋白,采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞的总蛋白质,用PDuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质。结果在空白对照组检出159个蛋白斑点,在异烟肼处理组检出221个蛋白斑点,在相对分子质量30 000~90 000和pH值4.5~6.0范围内,异烟肼处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。结论异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,提示异烟肼处理后促进了某些特定基因的表达。

肝癌细胞株HepG2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

采用双向电泳分离肝癌细胞株HepG2的G1期细胞的蛋白质,经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析显示:在pH3—10,13cm的IPG胶条上,可分离到227个重复性及分辨率均较好的蛋白斑点,蛋白斑点的匹配率为84%。建立了HepG2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。

2型糖尿病患者唾液双向电泳图谱的建立和分析

目的:建立2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱,观察2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质差异表达情况。方法:以优化的双向电泳技术分离唾液蛋白质,银染后用专业软件进行分析,建立2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:分别建立了正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱。结论:对比正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质图谱,鉴定出7种差异蛋白,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。

应用优化的双向电泳技术建立纤维堆囊菌So0157-2蛋白质组数据库(英文)

堆囊菌丰富的次级代谢产物是新药的重要来源,而蛋白质组学分析是研究代谢调控的有效方法.然而堆囊菌含有大量的胞外多糖以及黏液,干扰了蛋白质组学分析中蛋白质的溶解度、分辨率及重现性.为了高通量地筛选Sorangium cellulosumSo0157-2表达的特异性蛋白,实验优化了S.cellulosum So0157-2双向电泳方法.首先,S.cellulosum So0157-2蛋白在裂解液中有更好的溶解度.pH 3～10非线性胶条和1 mg的蛋白上样量适用于第一向等电聚焦,分别提高了蛋白质点的分辨率和低丰度蛋白质的表达.15%SDS-PAGE改善了S.cellulosum So0157-2蛋白分离的分辨率和重现性.最终,通过优化的双向电泳方法获得了S.cellulosum So0157-2在M26培养基中培养3天的全蛋白质表达谱,并检测到552个蛋白质点.进而对表达蛋白通过MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定,其中474个蛋白质得到鉴定,鉴定率85.9%.得到鉴定的蛋白质包括细胞结构和功能组分,以及细胞代谢合成酶类,其中8个蛋白质与糖类的转化和代谢相关,这有助于糖基化埃博霉素A的深入研究.该优化方法为进一步建立纤维堆囊菌So0157-2在各种培养条件下的蛋白质组表达数据库打下基础.

肝癌细胞株HepG2蛋白双向电泳条件的优化

目的优化双向电泳条件,以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。方法比较不同的细胞总蛋白质裂解液、不同的蛋白上样量、不同的等电聚焦电泳条件,选择最佳双向电泳条件。结果确定了适合肝癌细胞株HepG2的最佳细胞总蛋白质裂解液5、最佳蛋白上样量650μg和最佳等电聚焦电泳条件为最大电压34kV、30min。结论优化双向电泳方法获得的肝癌细胞株HepG2蛋白质双向电泳图谱高分辨率、重复性好。

适用于盐生植物的双向电泳样品制备方法

比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA)、三氯乙酸沉淀法(E-TCA)和酚抽法(Phe)3种方法对盐生植物盐角草(SalicorniaeuropaeaL.)总蛋白的提取效果。3种方法分别得到579、343和535个蛋白点;TCA和E-TCA法所得图谱均存在严重的横向纹理,Phe法所得图谱则背景干净,基本上没有纹理。说明Phe法不仅能很好地提取盐角草蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。对Phe法的提取液进行了改进,所得图谱背景更加清晰,蛋白点数增加。为其他盐生植物以及嗜盐微生物蛋白质的提取提供了重要参考。

适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术

以黄麻品种‘9511’幼苗为试验材料,研究其根部蛋白提取方法的得率及不同的蛋白样品溶解方法、电泳上样量和IPG胶条pH范围对双向电泳图谱的影响。结果表明：采用三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取黄麻根部蛋白质,蛋白得率为80 mg/g;蛋白粉末溶解采用两次水化法,裂解液中含有7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质和1 mmol/L PMSF,能够较充分地溶解蛋白质,且制备的样品浓度能够满足双向电泳上样要求;上样量为400μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦（Iso-electrofocusing,IEF）采用pH 4-7、17 cm的IPG胶条时所得图谱质量最佳。研究表明,样品的制备及IEF有效除盐对获得理想的2-DE图谱非常关键;取材、染色等细节对2-DE的重复性影响很大。

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明,TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0mgg?1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350μg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。

旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析

目的鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白。方法应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24h的ES抗原的蛋白组分进行分析。结果SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62kDa～14.88kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28kDa～14.27kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02kDa)。T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21kDa～14.37kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71kDa～14.51kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同。2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11kDa～22kDa、25kDa～64kDa及100kDa～144kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7～8.2、4.5～6.5及5～7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12kDa～21kDa及25kDa～90kDa,所对应的pI分别为4～9.5与4.5～9.6。T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13kDa～16kDa、18kDa～22kDa及40kDa～55kDa,所对应的pI分别为4～7、3.8～6.2及5～9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10kDa～15kDa、17kDa～25kDa及29kDa～55kDa,所对应的pI分别为4.7～6.5、4.6～6及5～7。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同。

大豆种子萌发中蛋白质组成的双向电泳分析

采用双向电泳技术分析了大豆种子萌发时期蛋白质的差异表达。研究发现,在考染胶上,通过PDQuest分析,在成熟干种子和萌发种子的2-DE图谱上分别获得341和376个蛋白斑点,两个时期的2-DE图谱非常相近,说明绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未开始降解。有21个蛋白点在萌发的大豆种子中表达量上调,9个表达量下调。对这些蛋白的进一步鉴定将有助于深入理解大豆种子萌发过程的生理及分子机制。

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

【目的】建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础。【方法】对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条p H范围等关键步骤进行优化。【结果】采用三氯乙酸/丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl（p H 8.0）裂解缓冲液,上样量为100 mg,以p H 4~7、18 cm的IPG胶条在12%SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱。【结论】建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持。

红麻细胞质雄性不育系与保持系总蛋白提取及双向电泳体系优化

为探讨红麻细胞质雄性不育形成的分子遗传机理,以红麻细胞质不育系L23A和保持系L23B开花期叶片为材料,对其红麻蛋白质双向电泳体系进行研究,比较TCA/丙酮和酚抽提法提取红麻叶片总蛋白,同时优化上样量和样品制备方法,建立了红麻蛋白质的双向电泳技术体系和凝胶成像染色法,利用PDquest软件分析双向电泳凝胶的相关差异蛋白。结果表明:(1)TCA/丙酮法比酚抽提法更适合于ISO-DALT电泳系统;(2)TCA/丙酮提取的红麻叶片粗蛋白平均产量为31.67 mg/g,是酚抽提法的1.77倍,但裂解效率为160 mg/g,是酚抽提法的36%;(3)每根胶条最佳上样量为300μg;(4)考马斯亮蓝G-250比R-250以及银染色法效果更佳,在17 cm×17 cm的凝胶上平均可获得708个蛋白质点。本研究建立的红麻细胞质雄性不育系与保持系总蛋白提取方法及双向电泳体系,可为揭示红麻雄性不育分子机理奠定基础。

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理 1、3、5d后 ,用酚法和TCA 丙酮法提取叶的可溶性蛋白 ,进行双向电泳 (2 DE)分析 .结果显示 :(1 )三种缺铁胁迫的可溶性蛋白 ,在不同的pH范围中 2 DE图谱上的比较 .使用pH3～ 1 0宽范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳分离后利用Z3图象分析软件 ,可在SDS PAGE凝胶上检测到 4 5 0个左右的蛋白点 ,酸性蛋白占 89% .选用pH4～ 7窄范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳后可在SDS PAGE凝胶上检测到 6 0 0个左右的蛋白点 ,其中缺铁诱导上调表达的有 2 9个点 ,减弱表达的有 1个点 ,诱导特异表达的有 5个点 .(2 )不同方法提取可溶性蛋白的差异 .酚法提取的蛋白再溶性好 ,纯度较高 .TCA 丙酮法简单易操作 ,蛋白损耗少 ,在 2 DE图象上 ,碱性端显示的蛋白点较多 ,但此法的缺点是再溶性差 ,对 2

烟草叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

以烟草品种K326旺长后期叶片为材料,用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对5种蛋白质提取方法(TCA/丙酮沉淀法、Mg/NP-40法、苯酚法、TCA-苯酚法和可溶性蛋白质提取法)进行比较,并对自制管胶pH范围进行探索。结果表明:苯酚法图谱中蛋白质条带最多、最清晰,并可获得较高纯蛋白质得率,为0.0420%,且图谱中蛋白质条带数最多、最清晰。自制管胶pH范围优化试验结果表明,以两性电解质pH 3-10与pH 5-8比例为1:3的2-DE图谱质量最佳,蛋白质可得到较好的分离。

石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析

【目的】石榴果实色泽是影响果品商品价值的重要因素之一,但石榴果皮颜色形成的分子机制还不清楚。应用差异蛋白组学技术,从蛋白水平上探究石榴果实发育成熟期果皮的代谢进程。【方法】运用双向电泳和MALDI-TOFTOF MS质谱鉴定技术研究‘三白’石榴和‘中农红’石榴果实成熟时果皮蛋白质组学差异。【结果】分别对‘三白’、‘中农红’石榴进行2-DE和质谱鉴定,在‘三白’和‘中农红’石榴果皮的电泳图谱中发现每一张重复胶上分别可以检测到892个蛋白点和890个蛋白点,与‘中农红’相比,在‘三白’果皮图谱中共检测到36个表达量相差2倍以上的蛋白质点,相对于‘中农红’,‘三白’有13个蛋白质点上调表达,19个蛋白质点下调表达。通过质谱鉴定和数据库检索注释了4个蛋白质点。分别为半胱氨酸合酶1(sport 1402)、细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)及果糖激酶2-like(sport 0503)。【结论】细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能与果皮颜色变化相关;半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起到了重要作用。为研究石榴果实发育蛋白质组学及改善石榴果实品质提供一定的理论依据。

小麦穗突变体Sda1与其野生型叶片总蛋白双向电泳体系的建立

为探索适合小麦穗突变体Sda1叶片蛋白的双向电泳体系,寻找Sda1与其野生型叶片的差异蛋白,以Sda1与其野生型的抽穗期叶片为材料,从蛋白质提取、双向电泳条件等方面对适合Sda1及其野生型叶片蛋白的双向电泳体系进行探索。分析试验得到的双向电泳图谱,发现利用TCA/丙酮提取叶片总蛋白,用pH 4~7的17cm线性胶条,采用13%浓度的分离胶,上样量为900μg,利用改良的等电聚焦程序,能够得到背景清晰、分辨率高的电泳图谱;电泳图谱在低分子区蛋白点分布均匀,并且重复性好。利用PDQuest 8.0.1软件分析图谱,得到27个差异点蛋白,相比于野生型植株,Sda1突变体表现为蛋白表达量下调与缺失,发现6个缺失蛋白,21个表达下调蛋白。

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点。方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点。结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失。结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础。

双向电泳和肽质量指纹谱技术鉴定支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白质ANX1-human

采用 2 - D PAGE及质谱技术对α粒子照射诱发人支气管上皮恶性转化细胞的不同阶段进行了比较蛋白组分析与鉴定 .2 - D电泳后在分子量 1 4.4～ 94k D,等电点 3～ 1 0范围内分离出约 1 1 0 0个不同蛋白质斑点 .对等电点约 7,分子量约 40 k D的蛋白质点进行了质谱分析 .鉴定出分子量为38.58k D、等电点 6.64的蛋白质 ANX1 - human(脂皮质蛋白 ,lipocortin ) ,并且发现该蛋白质在BEP2 D细胞恶性转化过程的不同时期存在差异表达 .提示蛋白质 ANX1 - human参与了支气管上皮细胞恶性转化过程 ,与细胞恶性转化相关 .