小麦Glu-D3和Glu-B3位点LMW-GS基因特异引物设计与PCR扩增

用CTAB法提取小麦基因组DNA ,根据GenBank中公布的已知LMW GS基因序列 ,设计并合成染色体位点特异PCR引物 1～ 7;利用特殊小麦材料———六倍体普通小麦阿勃二体、1A、1B和 1D缺体 ,四倍体小麦及二倍体的一粒小麦和节节麦的基因组DNA为模板 ,在优化的PCR体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明 :引物 3和引物 4为小麦谷蛋白Glu D3位点LMW GS基因特异PCR引物 ,用其进行扩增时 ,循环反应条件为 :94℃变性 1min ,6 2℃退火 1min ,72℃延伸 2min。扩增产物大小约 1.6 0kb ,包括了启动子和完整编码区。引物 5和 7为小麦谷蛋白Glu B3位点LMW GS基因特异PCR引物 ,用其进行扩增时 ,循环条件为 :94℃变性 1min ,6 4℃退火 1min ,72℃延伸 2min。扩增产物大小约 1.4 5kb左右 ,包括了启动子和完整编码区。此外 ,用引物 3和 4通过PCR技术克隆到小偃 6号小麦Glu D3位点LMW GS基因(登录号为AY2 6 336 9) ;该基因编码的LMW GS含 9个Cys残基。这是首次发现含 9个Cys残基的LMW GS基因。它可能是小偃 6号加工品质优良的主要原因之一。

31个SNP位点多重PCR扩增和芯片分型技术的建立及其法医学应用

目的对SNP基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据SNP不同等位基因的序列设计探针,制成分型芯片。采用4个复合PCR体系,用末端标记了Cy5的引物进行复合PCR扩增,产物与寡核苷酸探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值确定样品在各SNP位点的基因型。将这一方法应用于109份样本的分型,根据基因型分布统计分析31个SNP位点的法医学应用价值。同时,进行家系调查和方法灵敏度分析。结果方法的灵敏度为1ng;所检测的31个SNP位点的累积个体识别率为0.9999999999979(偶合率为2.13×10-12),二联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9609,三联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9970。家系调查的结果表明,这些位点等位基因由亲代向子代的传递符合孟德尔遗传定律。结论上述31个SNP位点为中高信息量位点,适用于法医学个体识别,可作为当前STR系统的补充。

小麦春化相关特异性PCR扩增体系的建立

以小麦幼苗DNA为模板 ,采用小麦春化相关特性Verc2 0 3序列设计合成的春化特异引物 ,进行PCR扩增。通过对扩增体系中引物浓度、Taq酶浓度、Mg2 + 、退火温度以及扩增程序的选择优化 ,确定了PCR扩增的最佳条件 。

利用PCR技术体外扩增牛Y染色体特异DNA序列的研究

本实验建立了用ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列的方法。根据牛的ＳＲＹ序列设计一对引物，两条引物均为２３ｂｐ，对公牛１９４ｂｐ序列进行体外扩增。从屠宰的公、母牛肝和血液中提取ＤＮＡ，用作ＰＣＲ模板，ＰＣＲ仪内进行扩增。结果表明公牛个体样品显示清晰可见的特异ＤＮＡ扩增带，而母牛个体样品无扩增片段出现，与预期的结果完全符合。

基于序列特异扩增区域标记的栗疫菌巢式PCR检测技术

为建立栗疫菌(Cryphonectria parasitica)快速、准确的检测技术,利用随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)对不同来源地的栗疫菌和其他真菌分离物进行PCR扩增,筛选出栗疫菌的RAPD特异片段SCQ494。将特异RAPD片段SCQ494进行分离、回收,与载体pMD19-T载体连接,转化至大肠埃希菌进行培养,对目标片段克隆测序。根据测序结果,用Primer 5.0软件设计了序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)引物CQ1/CQ2和巢式PCR引物CR1/CR2。利用引物CQ1/CQ2通过常规PCR对不同来源地供试栗疫菌可扩增出1条约1 420bp的条带,对其他供试菌株DNA的PCR产物均无此条带,检测灵敏度为3pg/μL的基因组DNA;而以引物CQ1/CQ2为外圈引物和引物CR1/CR2为内圈引物进行的巢式PCR可从栗疫菌基因组DNA中扩增出1条大小约875bp的条带,灵敏度达到30fg/μL,是常规PCR的1000倍。验证实验表明巢式PCR可以从发病程度不同的栗树枝干和在自然感染的栗树枝条中检测出栗疫菌。

用PCR扩增X-Y-特异片段性别鉴定的研究

采用5%Chelex-100处理方法提取 DNA,用 PCR 扩增 Amelogenin 基因片段检测血痕和毛根的性别。扩增一个样品只需1/10体积3mm^2血痕 Chelex-100处理液或1/10体积一根毛发 Chelex-100处理液(含模板 DNA)。100例血液样品结果显示,在男性可同时显现977bpX 特异片段和788bpY 特异片段,而在女性只观察到977bp X 特异片段,该方法用于性别鉴定可靠、灵敏、方便。

应用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别的鉴定及移植

本研究是用直接测序技术测定了奶牛SRY的DNA序列,在此基础上设计和合成了牛类SRY特异引物并通过聚合酶链反应(PCR)直接扩增牛胚胎的SRY特异DNA序列,对胚胎进行性别鉴定并移植成功。 研究方法是:由牛静脉血中的白细胞提取DNA,经扩增后直接测定DNA的序列,在此基础上,设计并合成了两对特异于牛SRY序列的PCR扩增引物A、B和C、D。对32头奶牛的白细胞DNA及17枚胚胎(全胚、二分胚、三分胚)的SRY序列进行PCR扩增。实验结果表明,32头奶牛的白细胞DNA 样品,其中有12头公牛样品均显示清晰的特异扩增带,20头母牛样品和空白对照样品均无特异扩增带。17枚奶牛胚胎用引物A、B“一次扩增”结果,有10枚胚胎出现清晰的特异扩增带,另7枚胚胎无特异扩增带,其中2枚三分胚共6个样品,其结果完全一致。用引物C、D进行“二次扩增”的10枚显示特异扩增带的胚胎均显示出另一条清晰的特异扩增带,而另外7枚未显带的样品亦均无特异的扩增带。为验证扩增的SRY序列,特设计了特异于牛SRY的ASO探针(寡核苷酸探针)进行点杂交。结果表明,凡有特异扩增带的均出现阳性杂交结果;相反,无特异扩增带的PCR产物均为阴性杂交结果,证明 扩增的为SRY特异DNA片段。经过性别鉴定的牛二分胚,已有4枚胚胎移植成功。其结果均与胚胎性别鉴定结果相符合。

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

DNA的apoB位点扩增片段长度多态性的检测及其在法医学中的应用

用PCR方法对100例无关个体血样的apoB位点扩增片段进行研究,已发现有11个等位基因,片段长度分布于600～1100bp之间,基因频率为0.005～0.525,杂合度为70％。家系分析及对人体血液、血斑、精液、精斑、混合斑、带毛囊毛发及其它各种有核细胞组织的研究表明,该技术在个人识别及亲子鉴定上均能发挥重要作用。

有关PCR扩增过程中的疑虑与剖析

PCR就是聚合酶链式反应的简称,是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。虽然人教版教材仅用不到400个字和两幅图作了简单介绍,但基于PCR在基因工程中的重要地位,使得涉及到的训练越来越多、越来越难,相关的疑问和剖析大致有以下一些。

大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价

【目的】大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)是微生物肥料重要的功能菌种之一,可通过生物固氮为大豆生长提供氮素,实现节本增效,菌株5873作为其典型代表,已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物,建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法,对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料,基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列,以及与其高度同源(基因组ANI值大于99.95%)的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段,通过多重序列比对,进行特异引物设计和筛选,获得特异性引物对,并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测,建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后,采用盆栽试验,将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际,应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′),优化并建立了PCR快速检测方法,即反应体系:Premix TaqTM 12.5μL,引物各1.0μL,基因组DNA 15 ng左右,加ddH2O补足至25μL;反应条件:95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环,再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无(355和218 bp),即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测,该方法检出灵敏度为1850 CFU/μL。此外,借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力,与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板,直接进行PCR扩增的鉴定操作,省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节,大大减少了工作量,只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873,为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）基本原理和特点

扩增片段长度多态性（AFLP）是建立在RFLP基础上的选择性聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction．PCR），它的基本原理是对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，将人工合成的特定双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，用这些特异片段为扩增反应模板，通过接头序列和PCR引物3’一端选择性碱基的识别，

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

3个STR位点在中国7个民族遗传距离中的研究

应用PCR技术、质量分数4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术,研究了D16S539,D7S820和D13S7133个STR位点在新疆锡伯族和哈萨克族中的遗传结构,结合汉族、黎族、朝鲜族、藏族和维吾尔族相同位点的相关遗传资料,应用亲缘系数和遗传距离研究了7个民族间的遗传关系,并根据遗传距离绘制遗传系统树。结果显示,汉族、朝鲜族、黎族、藏族和锡伯族为一群,而新疆哈萨克族和维吾尔族为一群。其中,汉族与朝鲜族遗传距离最近,其他依次为黎族、藏族和锡伯族。

细胞色素P450 2C19单碱基突变位点CYP2C19m1的分析

目的:CYP2C19ml是引起CYP2C19酶活性缺陷的主要等位基因,有83％左右的慢代谢者含有CYP2C19ml等位基因,本文试图建立一步PCR测定CYP2C19ml等位基因的方法。方法:根据等位基因特异扩增(ASA)原理设计两对分别特异扩增野生型等位基因和突变型等位基因的引物,建立了一步PCR测定CYP2C19ml等位基因的方法。结果:对39位随机受试者进行了基因分型研究,发现3位CYP2C19ml纯合子、18位CYP2C19ml杂合子,其余18位为野生型纯合子。结论:说明效法能够用于测定CYP2C19ml等住基因,并且证明该法具有简便、快速和污染少的优点。

微小按蚊A、C的PCR和同工酶鉴别比较研究

目的比较PCR和同工酶两种鉴别微小按蚊A、C亲缘种的方法。方法将现场采集后经形态初步鉴定为微小按蚊的样本,经PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)与乌头按蚊和杰普尔按蚊区分,等位基因特异扩增法(PCR-ASA)进一步鉴别微小按蚊A和C。再将用此方法鉴别后的微小按蚊羽化24h内单只虫体样本,采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳,加以辨别区分。结果经测序验证,PCR方法可以简单明确地将微小按蚊A、C加以鉴别。几种用于鉴别的同工酶中,只有酯酶(EST)同工酶对微小按蚊A、C具鉴别意义。结论对于微小按蚊A、C的鉴别,PCR方法明显优于同工酶方法。

线性扩增介导的PCR方法用于检测慢病毒载体在白血病细胞基因组中插入位点的可行性

目前，病毒载体基因转导技术是基因治疗中最为成熟的生物学方法，其中逆转录病毒载体，因其具有可直接整合于宿主细胞基因组并能够长期稳定表达的特点而成为临床基因治疗的核心技术，分析病毒载体在宿主染色体中插入位点的常用方法包括Southern blot、RT-PCR等，这些方法均需要足量含高拷贝数已整合有病毒载体的样本DNA以获取有用的序列信息，且受到靶序列的大小、位置及构象的限制，故其灵敏度较差。

sARMS-PCR检测非小细胞肺癌肿瘤组织中KRAS、BRAF基因突变研究

目的针对非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织标本鼠类肉瘤病毒癌基因同源基因(KRAS)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)驱动基因突变使用特异引物双扩增实时蝎形探针扩增阻滞突变系统(sARMS-PCR)检测的可行性;了解KRAS和BRAF基因突变患者临床病理特征,为NSCLC患者个体化治疗提供理论依据。方法收集89例NSCLC患者肿瘤组织甲醛固定石蜡包埋标本(FFPE),采用FFPE样品DNA分离试剂盒(离心柱型)提取DNA,使用sARMS-PCR同时进行KRAS及BRAF基因突变检测。结果1 KRAS基因突变21例(21/89);其中KRAS基因7种热点突变中,检出6种热点突变,均位于第12、13位密码子,1例同时检出存在G12D及G12V位点突变,1例同时检出存在G12C及G12V位点突变;未发现G12S突变型;2 BRAF基因突变1例(1/89),突变位点为V600E,为女性,黏液腺癌;3未见KRAS和BRAF基因同时突变现象。结论临床使用sARMS-PCR技术检测NSCLC患者KRAS和BRAF基因突变有较强敏感性,且石蜡组织标本取材方便,可以作为两种基因的临床检测方法;KRAS和BRAF基因突变与年龄、吸烟史、病理分型等均无明显相关性,KRAS基因突变与性别相关,男性高于女性;KRAS与BRAF基因是独立存在的。

燃煤型砷中毒患者皮损PTCH基因D9S287和D9S180位点微卫星不稳定性的观察

目的观察燃煤型砷中毒患者皮损组织中PTCH基因微卫星DNA不稳定性及杂合性丢失与临床病理、临床分度之间的关系。方法选取D9S287、D9S180两个微卫星多态性标记,采用PCR扩增-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法检测不同病理类型的燃煤型砷中毒患者的微卫星的改变。结果34例患者皮损组织PTCH基因微卫星不稳定性的发生率为29.41%(10/34),杂合性丢失的发生率为14.7%(5/34),微卫星的改变与病理分型相关(P<0.01),与临床分度无关(P>0.05)。结论PTCH基因微卫星不稳定性和杂合性丢失可能在砷中毒患者皮损癌变的发生发展中起重要作用。