利用双启动子表达载体pDH2-YggG-P_(tac)-Era研究E.coli Era和YggG蛋白间的相互关系

yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,研究表明该基因可能表达产物YggG294蛋白对宿主菌的生长具有强烈的抑制作用。为了阐明YggG294所引起的细菌生长抑制是否与Era相关,构建可同时可控性表达Era和YggG294蛋白的双启动子表达载体。利用所构建的双启动子表达载体在同一细胞中同时可控性地表达YggG294与Era蛋白。结果显示,在不表达和少量表达YggG294的细菌细胞内,Era的表达量与总蛋白量的比值随着诱导时间增加而增高,而YggG294大量表达的细菌内Era的表达量未明显改变,并且Era的表达量与总蛋白量的比值基本保持不变,但是在全细胞裂解液中并未检测到Era蛋白的降解产物;Era蛋白的预表达对YggG294表达所引起的细菌生长率下降无影响。上述结果说明,YggG294对Era蛋白无水解作用,YggG与Era蛋白间的相互作用与YggG294对细菌生长抑制作用无直接的联系。由此可以推论,Era与YggG294引起的细菌生长抑制无关,YggG294是通过其它途径引起宿主菌生长抑制。

利用双启动子载体构建产异丁醇大肠杆菌

为了实现异丁醇代谢途径中关键酶的高效共表达,选择具有双T7启动子的质粒载体pCDFDuet、pRSFDuet和pACYCDuet,将基因kivd和alsS分别克隆至pCDFDuet的两个启动子下,yqhD和ilvCD分别克隆至pRSFDuet或pACYCDuet的两个启动子下,构建成两种双质粒共表达系统,获得产异丁醇重组大肠杆菌Eco(CDF+RSF)和Eco(CDF+ACYC)。其中重组菌Eco(CDF+RSF)发酵产异丁醇达2.7g/L;而重组菌Eco(CDF+ACYC)产异丁醇能力较强,达3.5g/L。对两种重组菌目标蛋白的表达量及活力进行比较分析,发现重组菌Eco(CDF+ACYC)中实现了关键酶AHAS(alsS基因编码)和KDCA(kivd基因编码)的高效表达,对提高异丁醇的产量有重要的影响。利用双启动子载体成功构建了具有较高产异丁醇能力的重组菌Eco(CDF+ACYC),为后续改造以适应工业化生产打下了较好的基础。

人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选

[目的]构建人SUMO1的真核表达载体,筛选SUMO1的有效干涉靶点。[方法]将SUMO1亚克隆至载体pCMV-HA中。寻找可能的干涉位点,合成上下游引物,退火后直接克隆入GFP-HU双启动子载体。用WesternBlot和细胞荧光的方法检测各载体对外源性SUMO融合蛋白表达的影响,其后检测对内源性SUMO1表达的敲降效果。[结果]构建的人SUMO1真核表达载体pCMV-HA-SUMO1测序正确。针对267、279、293、309、342、386等不同干涉靶点构建双启动子干扰载体,其中293位点的干涉载体在WesternBlot和荧光检测试验中均表现出稳定的敲降效果,抑制了SUMO1的表达。[结论]该研究成功构建了SUMO1的真核表达载体及具有明显敲降效果的干涉载体,可为后续研究奠定基础。

癌症的靶向基因-病毒治疗新进展及抗癌策略

我们创导的“靶向基因-病毒治疗”又有新进展,即癌症的靶向双基因-病毒治疗,能将小鼠移植性肿瘤全部杀灭,研究结果发表于Hepatology及CancerResearch(Highlightpaper)等杂志。在得到好的抗癌作用后,我们着重研究其安全性,故本文又介绍一种独特的癌症双靶向病毒-双基因治疗,其特点是利用癌症特异性启动子调控其特异性抑制基因,如用甲胎蛋白(!-fetoprotein,AFP)调控肝癌特异性抑癌基因LFIRE或HCCS1等,并在此基础上再加一个癌症特异性启动子如hTERT控制腺病毒E1A,构成癌症的双靶向病毒-基因治疗药物,即hTERT-E1A-AFP-E1B-HCCS1(或LFIRE),然后再与一个杀伤功能很强的hTERT-E1A-AFP-E1B-IL-24联合作用,构成癌症的双靶向病毒-双基因治疗。双基因有很好的杀伤性,双靶向有很好的安全性,因此,成为目前开发前景良好的抗癌药物。此外,本文还介绍了一种新型干扰素,它也有可能成为理想的抗癌药物。