应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法,其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。

应用DPO技术检测番茄斑萎病毒方法的建立

为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术,以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因,设计了一对DPO引物,对PCR反应体系中的引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化,建立了TSWV的DPO-PCR检测方法,并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明,应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带,与预期目标相符。经过优化后,DPO-PCR反应体系(25μL)为:DNA模板1μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,d NTPs(每种2.5 mmol/L)2.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL,上、下游DPO引物(20μmol/L)各1.0μL,以去离子水补充至25μL。利用该检测方法,在49.8~70.0℃的退火温度范围内,均可实现目标基因片段的高效扩增,说明其对退火温度不敏感;利用病毒RNA进行检测,该方法的灵敏度为7.5 ng;通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明,仅TSWV呈现阳性反应,说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV,可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。