肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.

调控基因gacA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用

Pseudomonasfluorescens 2 P2 4分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤 ,该菌株能产生抗生素 2 ,4-二乙酰基藤黄酚 ( 2 ,4-diacetylphloroglucinol,2 ,4-DAPG)、氢氰酸 ,嗜铁素和蛋白酶 ,且抑菌谱广 ,可防治多种作物土传病害。本研究应用 Tn5转座突变技术 ,获得 1株产嗜铁素过量 ,同时不产生 2 ,4-DAPG、HCN、蛋白酶、不能形成生物膜 ( biofilm)的突变菌株PM3 3 90 ,其表现型与调控基因 gac A的突变体表型相似。通过 PCR介导的文库筛选方法 ,从 2 P2 4基因组文库中获得 2个含有 gac A基因的阳性克隆 ,进一步亚克隆 ,得到只含有完整 gac A开放阅读框的 1 .2 kb片段 ,互补实验表明其能恢复突变菌株的多种缺失表型。生测结果表明 ,gac A- 突变菌株与野生型 2 P2 4相比 ,对不同土传病害的生防效果均显著降低。以上结果证实 gac A在 2 P2 4中具有整体水平的调控功能 ,并在 2 P2 4防治土传病害中起到重要的作用。

荧光假单胞菌2P24调控基因突变体定殖能力和生防效果分析

在温室盆栽条件下,研究了分离自小麦全蚀病自然衰退土壤、可防治多种土传病害的荧光假单胞杆菌2P24菌株的2,4-二乙酰基间苯三酚合成基因突变体、GacS/GacA双因子调控系统突变体,以及PcoR-PcoI群体感应系统的突变体菌株在植物根围定殖能力和防病效果。结果表明,2,4-二乙酰基间苯三酚生物合成突变体不影响菌株在植物根部的定殖;GacS/GacA双因子调控系统中任一因子的突变菌株和pcoI-突变菌株显著降低了菌株在植物根部的定殖能力。温室病害防治试验结果表明,与野生菌2P24相比,phlD-,gacS-,gacA-,pcoI-突变体对小麦全蚀病和番茄青枯病生防效果均显著降低;而相应的互补菌株生防效果恢复到野生型的水平。结合前期工作结果,我们推测GacS/GacA双因子调控系统和QS系统在2P24菌株定殖和防病过程的信号传递上形成级联途径。

荧光假单胞杆菌2P24中生防相关调控基因gacS的克隆和功能分析

荧光假单胞杆菌2P2 4菌株分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,可产生多种次生抗菌物质,对一些作物土传病害具有较好的防治能力。通过PCR介导的方法从荧光假单胞杆菌2P2 4的基因组文库中克隆到调控基因gacS。序列分析发现,该基因长度为2 75 4bp ,编码917个氨基酸的肽链。此肽链与Pseudomonaschlororaphis双因子组分之一的感受激酶GacS相似性达91% ,与P .fluorescensCHA0的GacS相似性为89%。与野生菌株2P2 4相比,gacS基因的缺失突变体完全丧失产生抗菌代谢物2 ,4_二乙酰基间苯三酚、氢氰酸、蛋白酶的能力。拮抗试验中,gacS缺失突变体丧失对小麦全蚀病菌的拮抗作用,温室生物测定显示gacS的缺失突变体对小麦全蚀病的生防能力大幅下降。但是gacS基因的互补突变体能够恢复产生抗菌次生代谢物的能力,且重新获得拮抗能力和生防能力。由此证明GacS是生防菌株2P2 4中一个控制生防因子并影响生防效果的重要调控元件。

链霉菌次生代谢中双因子调控系统的研究进展

链霉菌次生代谢产物的生物合成受到严格和复杂的调控,而双因子调控系统是其中重要的一类调控因子,在链霉菌中广泛存在,且存在作用方式的多样性和作用机制的复杂性。就近些年研究较多的参与链霉菌次生代谢的两类双因子调控系统(真核型和原核型)的研究状况做了综述,重点阐明其作用机制,并对其研究趋势以及在药物代谢工程中的应用前景进行了展望。

铜绿假单胞菌重金属离子耐受性调查及相关机制的研究

旨在调查铜绿假单胞菌临床菌株对多种重金属离子的耐受性,并对相关机制进行初步研究。测定临床菌株在含有重金属离子培养基中的生长状况;构建转录融合报告基因,分析铜绿假单胞菌中RND外排泵CzcCBA的表达水平;PCR方法结合DNA测序分析调节基因czcR和czcS的序列差异。结果显示,158株铜绿假单胞菌临床菌株中,大多数耐受0.002 mol/L Co2+,1株不能在0.001 mol/L Co2+条件下生长,对照菌株ATCC27853在0.003 mol/L Co2+条件下能够生长。分析其中2株临床菌株和对照菌株ATCC27853对其它重金属离子的耐受性,结果显示其耐受趋势与Co2+一致。进一步分析了转录融合报告基因czcC-lacZ在临床菌株中的表达水平发现,β-半乳糖苷酶活力与重金属离子耐受性一致,重金属离子能够诱导β-半乳糖苷酶活力的提高。对操纵子czcCBA的调节基因czcR和czcS序列分析显示,3株菌株中调节蛋白CzcR的氨基酸序列相同,而蛋白CzcS的氨基酸序列则存在多处差异。得出结论,铜绿假单胞菌临床菌株对重金属离子存在耐受性,耐受程度与外排泵CzcCBA的表达水平相关,调节蛋白CzcS某些氨基酸的突变,可能改变了操纵子czcCBA的表达水平。

枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用

PhoR/PhoP双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统,在低磷环境下,感应激酶PhoR自磷酸化,并且将获得的磷酸基团转移到调控因子PhoP上,从而激活PhoP的调控活性。为了明确调控因子PhoP对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中主要抑菌活性物质-fengycin合成能力的调控作用,本研究通过同源重组技术缺失突变NCD-2菌株中的phoP基因,拮抗活性测定结果表明,phoP基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性。通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术比较了NCD-2菌株野生型及其phoP基因突变子fengycin的合成能力,结果证明,phoP基因突变菌株降低了fengycin的合成能力。对突变子进行phoP基因互补发现,互补phoP基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平。以上结果证明,phoP基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能。