SurvivinshRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响

目的在转录后水平进行干预的RNA干扰技术在多基因治疗中的应用越来越广泛。文中旨在构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过联合RNAi和外源性补充的方式研究Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对结肠癌裸鼠移植瘤生长情况的影响。方法选取35只裸鼠随机数字表法分为5组,即Survivin shRNA-APC双基因组、Survivin shRNA组、APC组、空载组和空白组,每组7只;将已经构建好的处于对数生长期的双基因共表达Survivin shRNA-APC、Survivin shRNA及APC稳转株,空载稳转株,HT-29结肠癌细胞(均为2×106/mL)分别注射至5组裸鼠左前腋下成瘤,构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型;通过测量瘤体体积、重量,检测移植瘤生长抑制率,Real time PCR检测移植瘤组织survivin mRNA的表达,免疫组化检测Survivin蛋白的表达,TUNEL检测凋亡情况。结果与空白组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组移植瘤平均体积、平均重量均减少(P<0.05);与空载组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组平均体积、平均移植瘤重量亦减少(P<0.05),而体积抑制率、瘤重抑制率均增加(P<0.05);与双基因组比较,APC组、Survivin shRNA组移植瘤平均体积、平均重量均增加(P<0.05)。与空白组和空载组相比,APC组、Survivin shRNA组、Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量明显降低(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量亦明显降低(P<0.05)。与空白组裸鼠移植瘤组织结肠癌细胞凋亡指数[(9.89±0.31)%]比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组[(31.19±1.79)%、(33.64±2.03)%、(56.72±3.17)%]明显升高(P<0.05),而APC组、Survivin shRNA组、双基因组亦较空载组[(10.06±0.43)%]明显升高(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织癌细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。结论 Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体能够使Survivin基因的表达水平降低,促进结肠癌细胞的凋亡,抑制移植瘤的生长,且优于单个基因的影响。

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。

双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗载体的改造及其体外表达特性

PCR扩增西门利克森林病毒(SFV)亚基因组启动子26S序列及人工合成Linker,将其插入基于SFV复制子的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1的多克隆位点,获得含2个26S启动子并能同时驱动双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA2。为了验证pSCA2的表达能力,PCR扩增绿色荧光蛋白基因EGFP和红色荧光蛋白基因DsRed2,分别插入pSCA2的2个26s启动子下游,获得EGFP和DsRed2双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗pSCA2-EGFP/RFP。将pSCA2-EGFP/RFP转染BHK-21细胞,转染后24h,可同时观察到被转染细胞发绿色荧光和红色荧光,证实EGFP和DsRed2均获得表达。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。

猪链球菌2型MRP和EF双基因共表达重组腺病毒载体的构建

旨在构建猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)双基因共表达重组腺病毒载体。根据猪链球菌2型MRP和EF的基因序列设计合成2对引物,以猪链球菌2型基因组为模板,扩增MRP基因(第1 801-2 513位)和EF基因(第1 783-2 563位)序列,并克隆到pMD18-T载体。然后将MRP基因、IRES元件和EF基因依次定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR鉴定。结果表明,克隆的MRP和EF基因测序正确,酶切重组穿梭质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物;线性化的重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF转染AD-293细胞6 d后也出现明显的细胞病变(CPE),在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP和EF基因片段。

成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建

目的探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因构建含目的基因的腺病毒载体的可行性。方法先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段．再接于Link序列T2A的两端，通过T2APeptide的互补，延伸得到BMP2-T2A—bFGF的全长PCR产物，利用上游引物的BglⅡ酶切位点和下游引物的EcoRV酶切位点将其插入到pShuttle—IRES载体中，酶切、测序鉴定；利用同源重组技术将目的基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体，鉴定阳性克隆；将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞，观察GFP表达，PCR鉴定后进行大量扩增，并用CsCl梯度离心法进行纯化；测量A260计算病毒感染滴度。结果克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确，经BglⅡ和EcoRV双酶切得到的BMP2-bFGF2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中；转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达，即病毒包装成功，扩增纯化后滴度为3．6×10^11 VP／ml。结论经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功。

血管细胞贴附分子-1和绿色荧光蛋白双基因共表达重组腺病毒的构建

目的构建血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用 DNA 重组技术,将目的基因 VCAM-1克隆至含有报告基因 EGFP 的穿梭质粒;在 BJ5183细胞中与 pAdeasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体。结果 (1)VCAM-1基因与 pAdTrack-CMV 载体成功连接,经

双基因共表达的重组腺病毒载体对人A549肺癌细胞的抑癌增效作用

生长抑制因子4（inhibitor of growth 4,ING4）基因是近年来新发现的一种肿瘤抑制因子,广泛参与肿瘤的发生及发展过程,并可增强化疗药物的敏感性.ING4主要在细胞内发挥抑癌作用.

间隙连接蛋白43和绿色荧光蛋白双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用 PCR方法从真核表达载体 pcDNA3.0-Cx43扩增 Cx43片断,利用 DNA 重组技术,将目的基因 Cx43克隆至含有报告基因GFP 的穿梭质粒 pAdTrack-CMV,然后在 BJ5183细胞中将重组穿梭质粒 pAdTrack-Cx43与

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。

人端粒酶逆转录酶基因和EGFP共表达真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人端粒酶逆转录酶 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达重组真核表达质粒。方法 扩增 pGRN1 4 5质粒并酶切回收hTERT片断 ,利用基因重组技术将hTERT连接到 pIRES2 EGFP载体中并酶切鉴定。用NucleofectorTM 技术将构建的重组质粒转染NIH3T3细胞系。结果 成功构建了hTERT和EGFP双基因共表达重组真核表达质粒 ,并成功转染了NIH3T3细胞。结论 重组质粒hTERT pIRES2 EGFP可以被成功导入细胞并表达EGFP 。

体外共表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白可形成异源二聚体

为了探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因编码的GP5蛋白和ORF6编码的M蛋白体外共表达特性,分别构建了PRRSV ORF5、ORF6单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5、pCI-ORF6和pCI-ORF5/ORF6,转染BHK-21细胞,Western blot检测证实共表达的GP5和M蛋白能够形成异源二聚体。同时,以绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)为示踪,发现当ORF5-EGFP和ORF6-RFP共表达时,能促进GP5蛋白从内质网向高尔基体转运,提示GP5-M异源二聚体的形成可能与GP5蛋白的翻译后修饰、转运、定位有关。

CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用

为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 .

组织激肽释放酶与基质金属蛋白酶抑制剂在血管重构中的研究进展

血管重构是动脉粥样硬化、高血压、血管再狭窄等血管重塑性疾病的病理生理过程。近年来研究表明,细胞因子和生长因子诱导的血管平滑肌细胞发生表型转化,丧失收缩功能并获得增殖、迁移和分泌细胞外基质的能力是该类疾病形成与发展的根本原因。现就组织激肽释放酶或基质金属蛋白酶抑制物,对血管重构的影响及其基因治疗在血管重构中的研究进展进行综述,为抗血管重塑性疾病提供新的治疗思路。

骨形态发生蛋白与组织工程：本刊中文部

1．重组人骨形态发生蛋白2缓释体影响细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达2．

新技术可促血管生成及骨再生

日前,中国科协和中国科技新闻学会共同推荐的一项研究论文指出,我国科研人员新近研发出一种促进血管生成及骨再生的新型物质——双基因共表达重组腺相关病毒载体。动物实验证实,该载体能够同时携带血管内皮生长因子（VEGF）及骨形态发生蛋白（BMP）基因，为骨坏死早期的基因治疗提供了实验基础。该研究发表在最新一期的《中国药理学报》上。

两个luxR基因对洛蒙真菌素生物合成的影响

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌合成的具有广谱抗菌活性的吩嗪类化合物。luxR调控基因是细菌中一类非常重要的调控基因,广泛参与调控细菌的初级代谢和次级代谢过程。本研究分析了洛蒙德链霉菌S015中两个luxR基因luxR4和luxR13对洛蒙真菌素合成的影响。通过在野生株中单基因过表达luxR4与luxR13,发现这两个基因均能促进洛蒙真菌素的合成,菌株S015L4和S015L13中洛蒙真菌素的产量分别达到野生株的3.7倍和2.4倍。进一步通过luxR4和luxR13双基因共表达,得到高产洛蒙真菌素的菌株S015L4-13,其洛蒙真菌素的产量达到野生株的4.2倍,为(230.2±8.3)mg/L。结果表明,基因luxR4和luxR13对洛蒙真菌素的合成起正调控作用,且两个基因具有一定的协同作用。本研究为揭示洛蒙真菌素的合成的调控机制及高产菌株的构建提供了依据。