加工食品中花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定的前处理方法探究与改进

目的构建一种可配合花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒实现对于加工食品中花生成分可靠检测的高质量样品前处理方法。方法对9种不同pH的提取缓冲液提取未处理、湿热处理、干热处理花生蛋白效果进行比较分析以确定最优提取缓冲液类型。而后,将吐温-20、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)以单独或组合添加的方式加入上一步获得的最优提取缓冲液中,提取3组花生蛋白,并对提取效果与夹心ELISA试剂盒检测花生蛋白回收率进行比较分析以确定最优添加剂配方。结果最终确定添加0.2%SDS和0.1%吐温-20的碳酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 9.6)为最优提取缓冲液。向碳酸盐缓冲液中加入SDS、吐温-20较好地提升了花生蛋白的提取率和回收率,将湿热处理花生蛋白回收率提高了2倍以上。结论本研究实现了对商业加工食品中花生成分的可靠检测,为推动过敏原信息在食品标签的准确标注提供了技术支撑,也为相关研究提供了参考。

酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法对乙型肝炎的诊断价值比较

目的比较酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在乙型肝炎诊断中的应用价值。方法选取120例疑似乙型肝炎患者作为本次研究对象,分别进行酶联免疫吸附测定法以及实时荧光定量PCR法检验。以病理检查为金标准,分析酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法的检查结果,对比两种检查方法的诊断效能,包括特异度、灵敏度以及准确度。结果120例疑似患者经病理检查确诊75例为乙型肝炎。酶联免疫吸附测定法检出阳性74例,阴性46例;实时荧光定量PCR法检出阳性75例,阴性45例。实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎的特异度、灵敏度以及准确度分别为93.33%、96.00%、95.00%,均明显高于酶联免疫吸附测定法的73.33%、82.67%、79.17%,差异有统计学意义(χ^(2)=6.4800、6.9963、13.3724,P<0.05)。结论采用实时荧光定量PCR法进行乙型肝炎的检测具有较高的准确率,可以为医生诊断和治疗方案的制定及调整提供良好的依据。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测鱼糜制品中鸡蛋卵白蛋白

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附(sandwich enzyme linked immunosorbent assay,sELISA)法检测鸡蛋卵白蛋白(ovalbumin,OVA)的方法,组装定量检测鱼糜制品中OVA含量的ELISA检测试剂盒。方法确定各步骤反应时间,使用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度,建立检测方法并对其性能进行评价。结果反应最佳条件为:抗原孵育20 min,检测抗体孵育20min,酶促反应显色10 min。兔抗OVA抗体为捕获抗体,工作质量浓度为1μg/mL,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗OVA抗体为检测抗体,1:5000(V:V)稀释。采用四参数逻辑曲线拟合标准曲线,所建立sELISA方法的检测范围为8.5~200.0 ng/mL,检出限为3.5 ng/mL,定量限为8.5 ng/mL。批次内和批次间的变异系数分别为2.31%~4.58%和6.06%~12.23%;鱼糜基质中的回收率为80%~130%;测得28种常见食物样品中4种样品的交叉反应率小于0.002%;试剂盒在4℃保存6个月期间,标准品检测结果的变异系数为4.29%~18.91%。结论建立的方法快速、灵敏、准确、稳定性好,可用于鱼糜制品中鸡蛋OVA的定量检测。

酶联免疫吸附测定与双抗原夹心法检测抗-HIV比较

目前血站检测无偿献血者的抗-HIV(人类免疫缺陷病毒HIVⅠ型和Ⅱ型抗体)一般采用的是间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法,此方法简便快捷,具有较高的灵敏度和特异性,且价格便宜,适用于献血员的筛选.

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

双抗原夹心法与间接酶联免疫吸附试验法检测丙型肝炎病毒抗体的应用效果分析

目的探讨双抗原夹心法与间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测丙型肝炎病毒抗体的应用效果,旨在分析两种检测方法的灵敏度及特异度,为血液筛查提供参考。方法选取2016年3月至2018年3月我县无偿献血者血液标本1200例作为研究对象,其中抗丙型肝炎抗体(抗-HCV)阴性标本1123例,抗-HCV阳性标本77例。采用双抗原夹心法与间接ELISA法分别进行检测,记录检测结果与丙型肝炎病毒核酸符合率,并进行统计学分析。结果77例抗-HCV阳性标本中,双抗原夹心法阳性检出率96.1%(74/77)高于间接ELISA法87.0%(67/77),差异具有统计学意义(P<0.05),双抗原夹心法检测及间接ELISA法分别有3份和10份假阴性样本出现;双抗原夹心法检测准确度、灵敏度、特异度均高于间接ELISA法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在检测丙型肝炎病毒抗体的方法中,相比于间接ELISA法,双抗原夹心ELISA法的检测结果较为理想,能够有效提高其阳性检出率、准确度、灵敏度及特异度。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测杏仁过敏原苦杏仁球蛋白

提取中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁球蛋白,分别制备兔和鼠多克隆抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法。结果表明:对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为(6.36±1.02)μg/L;对中国苦杏仁及美国大杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限分别为(12.11±1.70)μg/L和(18.95±1.52)μg/L,且与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛乳中杏仁过敏原的检测,苦杏仁球蛋白的添加回收率为78.94%～125.15%,且相对标准偏差均低于5.81%。

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测布氏菌抗原的实验研究

目的 建立检测布氏菌抗原特异、敏感和快速的试验方法。方法 在制备高滴度布氏菌抗体辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上 ,建立检测布氏菌抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (DAbS -ELISA) ,包括常规DAbS -ELISA及快速DAbS -ELISA。用建立的两种DAbS -ELISA法对布氏菌菌体抗原及可溶性抗原进行有关其特异性及敏感性对比观察 ;同时对模拟的这些抗原污染的饮用水标本进行对比观察。结果 常规DAbS -ELISA检测布氏菌 5 44A、16M、13 3OS及 10 4M的菌体抗原以及布氏菌 16M可溶性抗原的敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190万菌 /ml、2万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;用快速DAbS -ELISA法的敏感性分别为 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml;同时用这两种DAbS -ELISA检测上述抗原污染的饮用水标本其敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;以及 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml。而且这两种DAbS -ELISA法检测不含布氏菌抗原的所有对照均为阴性反应。结论 双抗体夹心酶联免疫吸附试验是检测布氏菌抗原的特异、敏感、快速和适用的试验方法。

改良双抗体夹心酶联免疫法测定重组人活性蛋白C含量的研究

研究用ELISA法直接定量检测细胞培养液中的重组人活性蛋白C(rhAPC)。用改良双抗体夹心酶联免疫检测法进行定量分析。用棋盘滴定法对包被抗体、反应一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗的适宜工作浓度进行了选择,并对实验条件进行优化,参考品标准曲线线性相关性较好。改良双抗体夹心酶联免疫检测法可用于直接定量分析细胞培养液中的rhAPC水平。

双抗原夹心酶联免疫吸附试验对丙型肝炎病毒抗体检测灵敏度及特异性的影响

目的:探究双抗原夹心酶联免疫吸附试验对丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)检测灵敏度及特异性的影响。方法:选取2016年5月~2017年4月我院进行手术和血液透析前抗-HCV检测的患者270例,经血液筛查(荧光定量PCR法)抗-HCV阳性12例,抗-HCV阴性258例,采用双抗原夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和间接ELISA分别对270例患者血清进行抗-HCV检测,比较两种检测方法的特异性、灵敏度。结果:双抗原夹心ELISA法灵敏度、特异性均高于间接ELISA法(P<0.05)。结论:双抗原夹心酶联免疫吸附试验可提高丙型肝炎病毒抗体检测灵敏度及特异性,可作为临床血液标本筛查首选方法。

一种检测人类血小板因子4的定量酶联免疫吸附实验

背景血小板因子4（PF4）是体内和体外检测血小板激活和α-颗粒分泌的标记物。PF4同时也是保存期间释放的主要的CXC细胞因子。血小板保存期间释放的细胞因子是引起非溶血性输血反应的原因。PF4的定量测定需要一种既可靠又灵敏的实验。为了达到这个目的，作者利用商业用的抗人类PF4抗体研制出一种灵敏、经济的三明治酶联免疫吸附实验（ELISA）。研究设计及方法研制的ELISA法用于检测人类血小板或激活的血小板分泌的PF4。

酶联免疫吸附(ELISA)法在食品微生物检测中的应用

本文对酶联免疫吸附(ELISA)法的应用原理以及方法进行了详细分析与介绍,并针对这种方法如何被有效应用于食品微生物的检测中进行了论述,从而为有关单位及工作人员在实际工作中提供一定的方法论支撑。在酶标记抗体技术基础上发展起了酶联免疫吸附测定法,它结合了放射免疫测定法与免疫荧光法的技术优点。

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明:所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^(-1),最佳线性范围为25~1 600 ng·mL^(-1),批内变异系数为1.65%~5.62%,批间变异系数为3.66%~6.81%,可检测出麻鸭各组织中ACE2含量。传染性浆膜炎组白鸭以及健康鸭心脏、肝脏等组织样品ACE2含量或表达存在差异,心脏组织中显著升高或上调;鸭传染性浆膜炎组心脏中ACE2 mRNA水平显著上调,肝脏组织中ACE2 mRNA水平升高不明显。采用该ELISA方法对不同畜(大鼠、猪、羊)、禽(鸭、鸡、鹅)的不同组织中ACE2进行了定量测定,证实该方法在不同畜禽上存在较大种属差异,仅适用于家禽ACE2的定量检测。综上,该研究成功建立了鸭ACE2检测的双抗体夹心ELISA方法,可用于禽类样品中ACE2的快速定量检测。

一种适用于教学的酶联免疫吸附试验的抗原抗体系统制备

目的:探讨设计一种教学成本低、便于教学使用、有助于培养医学生综合实验设计能力和提高实验基本操作技能的酶联免疫吸附实验抗原抗体系统。方法:以提纯的人IgG免疫家兔获取兔抗人lgG抗体,再用其包被酶标反应板,以人血清(人IgG)作抗原,用酶标记羊抗人IgG抗体结合抗原及催化底物显色反应。结果:该双抗体夹心法,底物显色反应清楚肉眼即可作出判定,非特异干扰极小。结论:我们设计的酶联免疫吸附实验——双抗体夹心法原理清晰、便于理解和掌握、教学成本较低、结果易于观察、便于教学大量使用。

3种酶联免疫吸附试验试剂检测丙型肝炎抗体结果分析

目的：通过对国产3种丙型肝炎病毒（HCV）抗体检测试剂盒间接法和夹心法检测的结果比较，分析评价双抗原夹心法试剂的性能。方法设计不同的试验方法，用3种试剂对收集的阳性和阴性标本进行丙型肝炎病毒抗体检测，对单试剂和双试剂呈阳性反应的标本同时进行第三组重组免疫印迹试验（RIBA）和核酸检测；另外，用已知浓度的质控物倍比稀释后，用3种试剂平行检测。对得到的所有检测结果进行比对，综合分析。结果与确证试剂相比，2种间接法试剂和1种夹心法试剂的假阳率分别为42.2％、57.8％和1.6％，阳性检出率均为100％，但夹心法的分析灵敏度比间接法高1～4倍。结论夹心法 ELISA 检测试剂在灵敏度、特异性方面优于间接法 ELISA 检测试剂。

大鼠血浆中重组人钙调磷酸酶B亚基的ELISA双抗体夹心法测定及其药动学研究

目的:建立大鼠血浆中重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的测定方法,并研究其药动学特征。方法:采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法,将1μg/ml的rhCNB单克隆抗体mAb包板,加入待测样品,再加入rhCNB多克隆抗体pAb(稀释比例为1∶5 000)和辣根过氧化酶(HRP)标记抗免疫球蛋白G(IgG)(稀释比例为1∶10 000),以四甲基联苯胺显色,用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(OD值)。测定6只大鼠iv 2.5 mg/kg rhCNB后2、15、30、60、120、240、480、720 min的血药浓度,以BAPP 3.0软件计算药动学参数。结果:rhCNB检测质量浓度的线性范围为0.195~12.5 ng/ml(r^2=0.995 0),定量下限为0.195 ng/ml,准确度为97.300%~103.622%(RSD均小于7.5%,n=6);批内、批间和反复冻融3次的RSD均不大于8.5%(n=6、18、15)。该药在大鼠体内的药动学特征符合二室模型,AUC_(0-720 min)为173.038 mg·min/L、t_(1/2)为94.62 min。结论:建立的方法特异性强、灵敏度高、准确度及精密度好,可用于生物样品中rhCNB的定量检测和药动学研究。

定量测定硫酸软骨素的双抗体夹心ELISA的建立

目的建立定量测定硫酸软骨素(CS)的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并对其应用价值进行初步评价。方法以CS为抗原分别免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,制备2种动物的多克隆抗体。用鼠抗体包被微孔板,兔抗体为第2抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体为标记抗体,建立双抗体夹心ELISA,并对线性范围、精密度、回收率和方法学比较进行了评价。结果本研究建立的ELISA线性范围为2～500 mg/L,批内和批间精密度分别为4.48%和5.97%,回收率在99.52%～101.77%之间,与间苯三酚分光光度法测定结果具有良好的相关性(r=0.999 0,P<0.05)。结论建立的定量测定CS的双抗体夹心ELISA具有敏感性高、重现性好等优点,适合检测应用。

双抗体夹心斑点金免疫渗滤法检测血吸虫循环抗原的现场应用

目的 探讨双抗体夹心斑点金免疫渗滤法 (S- DIGFA)在现场的应用价值。方法 在原已建立的以抗 2 6 k Da GST基因重组蛋白多克隆抗体为捕获抗体兼测示抗体的 S- DIGFA的基础上 ,应用该法检测血吸虫病中度流行区和传播阻断地区人群的血清共 1388份 ,并以双抗体夹心EL ISA(S- EL ISA)作对照。结果 用 S- DIGFA和 S- EL ISA平行检测血吸虫病中度流行区人群血清30 0份 ,阳性检出率分别为 15 .7%和 17.3% ;两法检测血吸虫病传播阻断地区人群血清 10 88份 ,阳性检出率分别为 3.9%和 3.7%。结论 S- DIGFA检测循环抗原可在现场扩大应用和作血清流行病学调查。

建立双抗体夹心法ELISA定量检测戊型肝炎p179疫苗

目的:建立双抗体夹心法ELISA检测HEV抗原,用于定量检测戊型肝炎p179疫苗生产过程中初制品、半成品和疫苗成品。方法:将单克隆抗体3G1、5G5、1G10、3A10和4E9分别进行辣根过氧化物酶标记,通过竞争ELISA检测确定最佳抗体配对用于建立双抗体夹心法ELISA,对p179生产过程中所得制品进行抗原定量检测。结果:5种单克隆抗体可以分成两组,分别针对p179疫苗抗原上的两种不同抗原表位,选择3G1为包被抗体、4E9为酶标抗体建立的双抗体夹心法ELISA具有良好的敏感性和特异性,对p179抗原检测的最低浓度可至15.6 ng·ml-1。该方法能够有效检测p179疫苗生产过程中的初制品、半成品和疫苗成品的抗原含量,反映抗原纯化各步骤的得率。结论:建立的双抗体夹心法ELISA可作为p179疫苗生产过程中的抗原检测方法,这有助于定量检测p179疫苗生产过程中的抗原成分。