光合细菌双层平板计数方法的研究

通过大量试验 ,证明双层平板法是光合细菌测数的较好方法。它弥补了传统方法的测数不准确、操作繁琐的缺点。通过正交设计试验 ,确定影响光合细菌测数的4个主要因素的最佳组合为 :底层培养基琼脂含量为0.8 % ,烤板时间为0.5h,上层培养基温度为50℃ ,上层培养基琼脂含量为1.0 %。

海水蛭弧菌分离纯化方法初步研究

蛭弧菌(Bdellovibrio)广泛存在于自然水体,它具有噬菌的特性,对水体中细菌数量控制具调节作用,有可能是进行生物防治的一种重要生物。本文比较不同分离方法、上层培养基营养盐浓度和富集培养与直接培养等对海水蛭弧菌分离、计数的影响,从而建立了海水蛭弧菌分离和纯化的方法。应用无营养盐的海水双层琼脂平板法,采用6种宿主菌分别对海南4份海水样品进行计数检测,发现不同宿主菌所得到的蛭弧菌数量不同,同时对分离纯化到的3株海水蛭弧菌进行液体培养增殖,进一步检验了海水双层琼脂法的可靠性。

一种制备高效价噬菌合格悬液的有效方法

介绍了一种制备高效价噬菌体悬液的方法，并将其产量和效价与传统方法所得结果进行了比较，结果证明该方法所得噬菌体悬液的效价和产量最高。

一种高效准确定量计数噬菌体肽库目标分子的方法

利用双层琼脂平板法与荧光实时定量PCR(Real-time PCR)技术分别测定少量、中量和大量噬菌体的效价。结果显示,双层琼脂平板法与Real-time PCR法均可准确测定噬菌体效价。双层琼脂平板法所得符合条件的平板约为总数的1/3,需重复测定10次,每次消耗噬菌体10μl,测得噬菌体效价的组内变异系数为4.93%～30.38%。Real-timePCR法重复测定3次即可,每次消耗噬菌体1μl,其组内变异系数仅为0.02%～0.25%,明显低于双层琼脂平板法。提示,Real-time PCR技术可简单、迅速地测定噬菌体效价。

几种检测乳酸菌抑制真菌性能的方法比较

为建立抑制真菌乳酸菌的高效筛选方法,该文比较96孔板法、牛津杯琼脂扩散法、打孔法以及双层平板划线法检测乳酸菌抑菌性能的简便性、灵敏性和可行性。结果表明,在测定乳酸菌发酵上清液抑制黑曲霉孢子生长的方法中,与通过测定透明圈的牛津杯琼脂扩散法与打孔法相比,96孔板法通过测定黑曲霉孢子经过乳酸菌发酵上清液培养后的吸光度值,在检测乳酸菌抑菌性能时较为灵敏且简便快捷;双层平板划线法通过测定在乳酸菌菌落周围形成的透明圈,在测定乳酸菌菌株及其发酵产物抑制黑曲霉孢子生长的抑菌性能方面效果明显,且与96孔板法相比更能显示出测试乳酸菌菌株间抑菌性能的细微差异。

肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体KP-ZS5的分离及鉴定

目的肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体KP-ZS5的分离及鉴定。方法以18株临床分离肺炎克雷伯菌为宿主菌,采用双层平板法从水样中分离肺炎克雷伯菌噬菌体并进行纯化,透射电镜观察噬菌体形态,提取噬菌体DNA及蛋白并测定其生理生化特性。结果成功分离到1株长尾肺炎克雷伯菌噬菌体,并命名为KP-ZS5,pH稳定性实验表明KP-ZS5不耐强酸(pH≤3);限制性片段酶切多样性(RFLP)分析表明,KP-ZS5基因组中存在3个BglⅡ酶切位点,预计总基因组大小为20000~30000 bp;裂解谱实验表明,KP-ZS5可以感染33%(6/18)的临床肺炎克雷伯菌株;SDS-PAGE结果显示,在KP-ZS5外壳蛋白由3种蛋白组成,外壳蛋白分子量为35~48 kDa。结论成功分离出1株长尾肺炎克雷伯菌噬菌体KP-ZS5,该噬菌体具有较广的宿主范围和pH值耐受性,外壳蛋白组成简单,仅含3种分子量为35~48 KDa的组分,具有在临床治疗肺炎克雷伯菌感染的潜力。

光合细菌菌数测定数学模型的构建

通过同一浓度的光合细菌菌液在不同波长吸收值的测定 ,确定322nm为光合细菌的最大吸收波长 ;在波长322nm下测定不同浓度菌液的光密度值 ,与双层平板法测数结果相对应 ,建立OD值和菌数之间的线性关系 ,推导出直线回归方程。应用此直线回归方程 ,测定光合细菌的菌数 。

微生物实验创新教学中开设蛭弧菌实验研究

通过双层平板法分离蛭弧菌,经硝酸银染色法对蛭弧菌的形态进行观察,让学生在现有微生物实验教学条件下认识和了解蛭弧菌的生物特性。实验结果显示:双层平板法成功分离到能形成明显噬菌斑的蛭弧菌;通过制片和银染,在普通光学显微镜检下可清晰辨析蛭弧菌侵蚀大肠杆菌和鞭毛等显微结构。该实验为拓展蛭弧菌综合实验和充分发挥高校微生物实验教学平台服务于学生的作用奠定了基础。

微生物实验教学中开设蛭弧菌形态观察和动态观察实验研究

用硝酸银染色法对双层平板培养法获得的蛭弧菌进行染色,利用相差显微镜和CCD DP27数码成像系统观察并记录到蛭弧菌形态和侵入大肠杆菌的过程以及蛭弧菌鞭毛的运动状态。同时,通过提高蛭弧菌菌体浓度可观察到蛭弧菌捕捉大肠杆菌的动态过程。该实验让学生更加清晰和直观地观察到菌体的形态及运动方式,激发对微生物实验的热情,促进创新性人才的培养,也为微生物实验教学平台的建设起到一定的推动作用。

东北酸菜发酵液中耐低温乳酸菌的分离及抑菌性研究

从东北地区低温(10～15℃)贮藏的酸菜发酵液中分离出25株乳酸菌,获得在10℃能良好生长的菌株CCT-1,经形态、生理生化和16SrDNA鉴定,该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。分别将MRS固体培养基与LB、查氏、牛肉膏蛋白胨和YPD半固体培养基组成双层平板,对大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及啤酒酵母(S.cerevisiae)4种指示菌进行抑菌性研究,结果显示:CCT-1对4种指示菌均有抑菌作用。利用牛津杯法研究菌液的最低抑菌浓度,测得CCT-1菌悬液稀释3倍时,细胞浓度为3.4×106cfu/mL,此时还存在抑菌作用,啤酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑菌圈直径分别为10,9.8,9,8.5mm,该研究可为冷藏食品的保藏提供生物防腐菌株。

产广谱细菌素乳酸菌CW3的筛选和初步鉴定

[目的]对CW3菌株进行筛选,并且进行初步鉴定。[方法]首先采用牛津杯双层平板法进行产广谱细菌素菌株的初筛,再将初筛得到的菌株进行排除酸和过氧化氢干扰,并检测抑菌物质的蛋白质性质,最终对复筛得到的菌株进行鉴定。[结果]试验得出,排除有机酸、过氧化氢等干扰因素后,发酵液仍有抑菌作用;用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后,发酵液抑菌活性急剧下降,确定产生的抑菌物质具有蛋白质性质,是一类细菌素。经过生理生化试验初步鉴定菌株CW3为植物乳杆菌。[结论]菌株CW3是一种能产广谱细菌素的植物乳杆菌。

嗜盐古生菌产嗜盐菌素情况的筛查研究

以Halobacterium salinarum NRC817为敏感指示菌,用双层平板法对武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏的19株嗜盐古生菌产生嗜盐菌素的情况进行了筛查,其中15株对Hbt.salinarum NRC817表现出明显拮抗,证实了前人的观点:分泌嗜盐菌素是嗜盐古生菌的普遍特征。

苹果多酚抑菌效果的研究

观测苹果多酚对细菌、酵母菌、霉菌生长的影响以及对各种供试菌株在测试浓度范围内的最低抑菌浓度,以期为新型安全天然食品防腐剂的研究提供一定的依据。采用双层平板打孔法,研究了不同质量浓度(2、6、10g/L)苹果多酚,对6种细菌、3种酵母菌及3种霉菌的抑制作用,对筛选出来的供试菌株,采用0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、2.0g/L8种不同浓度的苹果多酚进行测试浓度范围内最低抑菌浓度试验。结果表明:苹果多酚对黄杆菌SHL45、大肠杆菌、荧光假单胞菌SHL5、荧光假单胞菌SHL7、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌6种供试菌株,在苹果多酚测试浓度范围内的最低抑制浓度分别为0.6、0.7、0.6、0.6、0.8、0.5g/L,对金黄色葡萄球菌等6种供试菌株有明显的抑制作用。

竹笋壳提取物抑菌活性研究

以竹笋壳为原料,利用超声波辅助-有机溶剂提取法提取活性物质,并经大孔树脂初步纯化;采用双层平板打孔法研究竹笋壳提取物对食品中常见的4种细菌和3种真菌的抑制作用,同时考察温度和紫外照射对其抑菌活性稳定性的影响。实验结果表明:竹笋壳提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、大肠杆菌(Escherichia coli)这4种细菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为8.75、4.375、35、35mg/mL,对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus stolonifer)这3种真菌没有抑制作用;竹笋壳提取物的抑菌活性具有很好的热稳定性;对于不同菌种,竹笋壳提取物的抑菌活性具有不同的紫外光稳定性。

2株可感染大肠埃希菌工程菌的噬菌体的鉴定与分析

大肠埃希菌来源的基因工程菌是应用最为频繁的工程菌,但在基因工程菌规模化制备生物活性制剂的过程中常常会被噬菌体感染。通过对鸡粪中噬菌体大量筛选及鉴定,对工程菌防御相应噬菌体感染机制开展基础研究。实验以大肠埃希菌工程菌为宿主菌（CICC编号：10424）,采用双层琼脂平板法从鸡场粪样中分离噬菌体,结果获得2株噬菌体,对其进行形态学鉴定。经透射电镜观察发现一株（CX）为短尾噬菌体,其头部外廓呈长六角形,非收缩性尾部,其噬菌斑清晰透亮,周围无晕环,裂解性较强;另一株（B1X）为长尾科噬菌体,其噬菌斑呈双层环状,中心澄清透明,直径约0.8-1.3 mm,外环呈半透明,云雾状区域,宽约0.8-1.3mm。可进一步研究这2株噬菌体的侵染机制。

腌冬瓜中具有抑菌活性乳酸菌的鉴定及其抑菌特性的研究

利用双层平板法从浙东传统腌制冬瓜中筛选得到1株具有抑菌活性的乳酸菌,命名为L34.以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌为指示菌,利用牛津杯法测定乳酸菌发酵上清液的抑菌活性,发现其抑菌活性物质具有热稳定性,对部分蛋白酶敏感;抑菌活性随p H值的降低而增强,表现出对酸的依赖性.结合生理生化实验和16S r DNA序列比对结果,鉴定L34为植物乳杆菌.

C端带Myc和多聚组氨酸双标记的重组人β-防御素-2在COS-7细胞的转染表达

本研究旨在探索建立能有效表达和分泌人类β-防御素 - 2 (h BD- 2 ) ,其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线。将 h BD- 2的全长 c DNA片段插入编码双重报告基因 Myc和 6个多聚组氨酸 (His)的真核表达质粒 pc DNA3.1/Myc- His(+) ,构建出 C端带 Myc和 6× His的 rpc DNA3.1/Myc-His(+) /h BD- 2。用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入 COS- 7细胞 ,分别从 m RNA和蛋白质水平分析 h BD-2的表达情况并同步检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性。采用 RT- PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约 2 4 0 bp的片段 ,其大小与预测相符。采用 Western blot法 ,用抗 His抗体检测到细胞可溶性蛋白在约 10 Kd处有强反应条带显示 ,其大小与该重组质粒结构中由 p CMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量 (10 .1)相符。双层肉汤琼脂平板扩散法结果显示 :分别与正常细胞可溶性蛋白和培养上清比较 ,转染重组质粒的 COS- 7细胞的可溶性蛋白及培养上清在金黄色葡萄球菌的平板上均形成明显抑菌环。这些结果提示 :所建立的 h BD- 2哺乳类动物细胞表达系统能有效表达和分泌活性 h BD- 2。

亚硝基胍诱变丙酸杆菌选育高产抑菌物质菌株

[目的]提高丙酸杆菌代谢物的抑菌活性,为薛氏丙酸杆菌代谢物的工业化生产奠定基础。[方法]以实验室保藏的薛氏丙酸杆菌H1310为出发菌株,采用亚硝基胍(NTG)进行诱变处理,待突变菌株长出后采用双层平板筛选法进行筛选,而后通过深层液体发酵对筛选到的菌株进行复筛。[结果]当最优的NTG诱变浓度为0.3 mg/m L时,致死率为90.69%。采用双层平板法,从3 564株菌落中挑选出87株突变株,进一步进行复筛,获得一株突变菌株,其代谢物抑菌活性达(28.30±2.47)AU/m L,比出发菌株提高43.87%。[结论]确定了丙酸杆菌NTG诱变选育的试验方法,获得一株抑菌活性高的遗传性能稳定的菌株。

作用于大肠杆菌噬菌体的筛选

大肠埃希氏菌(E.coli),属称大肠杆菌。在特定条件下大肠杆菌可致病。近年来,由于兽医临床耐药大肠杆菌的不断出现,新抗生素的研制困难重重,而噬菌体(bacteriophage或phage)是一类细菌依赖性的病毒,能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌从而达到抗菌效果。因此研究大肠杆菌噬菌体用于防治大肠杆菌感染受重视。为了筛选出作用于大肠杆菌的噬菌体,通过水样法、双层平板法和点滴法从污水中筛选出噬菌体并进行分离纯化。结果发现,滴了噬菌体的部位出现了明显的噬菌斑,说明噬菌体对大肠杆菌发挥裂解作用。为进一步研究噬菌体与大肠杆菌相互作用提供理论基础。

嗜铁钩端螺旋菌氧化难处理金矿的研究

采用改良双层板方法从酸性矿坑水（AMD）中筛选、鉴定并命名为氧化效果最佳的分离株—嗜铁钩端螺旋菌（Leptospirillum ferriphilum）LJ-02。当温度在36~46℃范围内,矿石氧化率呈现出先升后降的趋势;降低pH对提高细菌氧化能力有着显著影响;在接种量不超过10%（v/v）的条件下,接种量的提高有利于矿石的生物氧化。该菌株对难处理金矿的吸附属于Langmuir等温吸附,其吸附平衡常数为8.72×10-10 mL/cells,单位质量矿物颗粒的最大吸收能力为1.99×109 cells/g。