双引物探针RT-Realtime PCR检测马铃薯A病毒

马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据PVA中CP基因(coat protein gene)的保守序列,设计了两套PCR引物和TaqMan探针,建立了双引物探针RT-RealtimePCR检测PVA的方法。该方法采用实时荧光PCR技术,有效地提高了检测的灵敏度;同时两套引物探针相互验证,有效提高了结果的准确性。实验结果表明,本方法准确、灵敏、简便、快速,检出低限可达0.5fg/μL植物总RNA。

应用特异双引物法标记DNA探针

作者应用位于探针DNA两端的两个DNA片段作引物,以探针DNA为模板,在大肠杆菌DNA聚合酶I的介导下,经过1—3次变性、退火和延伸过程,使探针DNA得到标记.3次实验结果表明,应用此法标记的DNA探针的比活性可以达到2×10^(14)cpm/g DNA,标记效率大于60％;而用缺刻翻译法标记的DNA探针,其标记效率只有22.7％.表明这是一种较好的DNA探针标记方法.

双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶病毒3

葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)被认为是葡萄卷叶病最重要的致病因子。本研究根据NCBI核酸数据库中葡萄卷叶病毒3复制酶基因序列保守区,设计合成2对上下游引物和1条Taq Man探针,组成2套反应组合。以病毒RNA反转录合成的c DNA为模板,依据2组引物序列和相同的Taq Man探针序列,在荧光PCR特异性、灵敏度、扩增效率对比试验的基础上,建立了双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测GLRaV-3的新方法,病毒RNA检测下限可达4.5 fg/μL。两套组合相互验证,减少非特异性扩增,进一步提高了方法的特异性。