双引物PCR检测抗草甘膦豆粕饲料中的转基因成分

在一个PCR反应体系内,同步扩增大豆内参照基因lec和抗草甘膦大豆外源基因盒中的CaMV35s启动子、nos终止子或cp4 epsps基因,建立转基因大豆双引物PCR检测方法。PCR产物用限制性内切酶酶切进一步鉴定。结果表明,用双引物PCR扩增出标准转基因大豆阳性对照、阿根廷大豆、美国RR大豆及豆粕中的lec基因和相应的特异性外源基因;酶切反应确证PCR产物为特定片段大小的目的序列。建立的双引物PCR法适用于抗草甘膦大豆原料和豆粕饲料中转基因成分的简单化、高精度和高灵敏检测。

sARMS-PCR检测非小细胞肺癌肿瘤组织中KRAS、BRAF基因突变研究

目的针对非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织标本鼠类肉瘤病毒癌基因同源基因(KRAS)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)驱动基因突变使用特异引物双扩增实时蝎形探针扩增阻滞突变系统(sARMS-PCR)检测的可行性;了解KRAS和BRAF基因突变患者临床病理特征,为NSCLC患者个体化治疗提供理论依据。方法收集89例NSCLC患者肿瘤组织甲醛固定石蜡包埋标本(FFPE),采用FFPE样品DNA分离试剂盒(离心柱型)提取DNA,使用sARMS-PCR同时进行KRAS及BRAF基因突变检测。结果1 KRAS基因突变21例(21/89);其中KRAS基因7种热点突变中,检出6种热点突变,均位于第12、13位密码子,1例同时检出存在G12D及G12V位点突变,1例同时检出存在G12C及G12V位点突变;未发现G12S突变型;2 BRAF基因突变1例(1/89),突变位点为V600E,为女性,黏液腺癌;3未见KRAS和BRAF基因同时突变现象。结论临床使用sARMS-PCR技术检测NSCLC患者KRAS和BRAF基因突变有较强敏感性,且石蜡组织标本取材方便,可以作为两种基因的临床检测方法;KRAS和BRAF基因突变与年龄、吸烟史、病理分型等均无明显相关性,KRAS基因突变与性别相关,男性高于女性;KRAS与BRAF基因是独立存在的。

蕹菜溃疡病菌分子检测方法的建立及田间监测

【目的】蕹菜是我国南方重要的经济作物,近年来随着蕹菜种植面积不断扩大,由穿孔黄单胞菌(Xanthomonas perforans)引起的蕹菜溃疡病日趋严重,对生产造成了巨大损失。建立高效快捷的蕹菜溃疡病菌检测技术,可为有效防控病害奠定基础。【方法】采用普通PCR检测技术,针对蕹菜溃疡病菌X. perforans基因组中特有序列TC2-1_002562(编码噬菌体终止酶大亚基家族蛋白)和TC2-1_002580(编码噬菌体家族蛋白)设计两对特异性检测引物,在同一个PCR体系中达到了快速检测蕹菜溃疡病菌的目的。【结果】建立的PCR检测方法可操作性强,对蕹菜溃疡病菌具有良好的特异性。利用特异性引物对来自广东多个地区的蕹菜植株、土壤和水体进行病原菌分子检测,发现第一批样本仅在5份来自东莞的蕹菜叶片上检测到病原菌,第二批样本分别在土壤、水体和植株上检测到病原菌。【结论】所建立的PCR检测方法能快速检测穿孔黄单胞菌,可用于对蕹菜溃疡病的早期诊断。该病在东莞、深圳等地呈普遍发生态势,田间检测结果表明,病害发展迅速,留种蕹菜种苗或种子很可能是该病的初侵染源,种植环境的水、土壤也是病害循环的重要环节,这对于今后进一步研究病害循环规律、制定针对性防控策略具有重要意义。

非小细胞肺癌患者eml4-alk基因检测及eml4-alk阳性患者临床特征分析

目的探讨棘皮动物微管相关蛋白4(eml4)与间变性淋巴瘤激酶(alk)融合基因阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的检测、临床特征、治疗、预后以及与egfr、kras、braf基因表达情况之间的联系。方法选取190例NSCLC患者石蜡包埋(FFPE)标本,采用免疫组化(IHC)法进行eml4-alk融合基因阳性NSCLC患者(eml4-alk+NSCLC)筛选,对于IHC阳性的标本使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测验证。收集整理eml4-alk+NSCLC的临床资料,并对其随访;对所有患者标本采用RT-PCR法进行egfr、kras、braf突变检测。结果190例NSCLC患者中,经IHC筛查及RT-PCR确证,共检出17例eml4-alk+NSCLC,其中手术标本最多,占47.1%(8/17)(χ~2=25.999,P=0.000),<60岁的占76.5%(13/17)(χ~2=5.813,P=0.016)。未显示eml4-alk融合基因与egfr、kras或braf突变同时出现的患者。在手术患者Ⅰ期未显示eml4-alk阳性肺癌,在Ⅱ~Ⅲa期检出8例eml4-alk阳性肺癌,经术后化疗25%(2/8)复发,2年生存率为100%。9例晚期eml4-alk阳性肺癌患者化疗有效率低(4疗程化疗后仅12.5%缓解),已有5例死亡。一线化疗后病情稳定或缓解的患者维持阶段口服克唑替尼的客观缓解率(ORR)与疾病控制率(DCR)分别达50%、100%。多线治疗后进展患者三线口服克唑替尼2个月ORR与DCR仍可达33.3%、66.7%。结论通过IHC筛查及随后RT-PCR可在各种病理标本中有效检出eml4-alk+NSCLC,其临床特征为<60岁的患者多见,而与性别、吸烟史等其他特征无明显关联。能够手术的较早期(Ⅱ~Ⅲa期)eml4-alk+NSCLC,接受术后辅助化疗预后较好;晚期患者一线化疗后病情稳定或缓解患者口服克唑替尼疗效较好。经多线治疗后使用克唑替尼仍然可提高其ORR及DCR,但获益有限。