双扩增法检测呼吸道病原体RNA的性能评价

目的对双扩增法RNA恒温扩增技术进行方法学性能评价。方法选取2020年5—9月因呼吸道感染就诊于上海中医药大学附属第七人民医院患者的咽拭子标本40例(含经聚合酶链反应荧光探针法判定的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体7种病原体阳性标本各5例,阴性标本5例),通过检测对比评价双扩增法检测7种常见呼吸道病原体RNA的准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性能力。结果对已知结果的40例呼吸道咽拭子标本进行7种病原体双扩增法检测,检测结果与原诊断结果一致,准确性100%;对稀释后的LOD1、LOD2和LOD33个梯度的灵敏度样品进行检测,各病原体灵敏度验证结果符合要求;7例病原体阳性标本和1例阴性标本每天分别重复检测3次,连续重复检测5 d,与原诊断结果一致,符合率100%;7种病原体之间及7种病原体与其他多种病原体之间无交叉反应;2 g/L的血红蛋白和1%(W/V)的黏蛋白对病原体检测结果无干扰。结论双扩增法检测RNA的准确性、灵敏度、重复性、交叉反应及抗干扰性能力均符合要求,具有准确、速度快、通量高等优点,是临床实验室病原体测定的可靠方法。

呼吸道病原体核酸双扩增法在儿童上呼吸道感染病原诊断中的应用研究

目的研究新型的多重核酸检测技术在儿童呼吸道感染的诊断价值。方法急性呼吸道感染病例43例,应用双扩增法及直接免疫荧光法对患儿的鼻咽拭子和咽拭子样本进行7种常见的呼吸道病原体的核酸检测,具体为甲型流感病毒(H1N1/H3N2)、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒(PIV1/PIV2/PIV3)、腺病毒(AdvB/E)、肺炎支原体和肺炎衣原体,同时应用直接免疫荧光法检测流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1、2、3型,对于2种方法检测结果不一致的样本,进行巢式PCR法进行检测。结果双扩增法阳性检出率为53.3%,复合感染率8.8%。除去肺炎支原体和肺炎衣原体指标外,与抗原直接免疫荧光法相比,阳性检出率提高了11.1%,复合感染检出率提高了4.5%,8例不一致的样本,双扩增法和巢式PCR法的检测结果一致率高于直接免疫荧光法。结论双扩增法可同时完成7种呼吸道病原体RNA检测,敏感性高、特异性强,为临床提供全面病原学鉴别诊断信息,辅助诊断呼吸道感染性疾病,具有较高的临床应用价值。

双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较

目的开展双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较性研究,为基层实验室建立手足口病科学快速检测方法提供依据。方法对2016年-2017年宜昌市9县市区采集的205份手足口病患者的咽拭子样本,同时采用双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病通用病毒、CoxA16、EV71,比较2种方法检测结果的差异,对2种方法检测结果相异的标本进行测序。结果双扩增法同real-time RT-PCR法检测结果比较,阳性标本数差异无统计学意义(x^2=0.743,P>0.05);且2种方法与测序方法结果比较,符合数差异无统计学意义(x^2=3.32,P>0.05)。结论双扩增法适合基层实验室推广使用。

人工修饰双等位基因特异性引物扩增法测定人ABC1基因突变点I823M

目的 建立一种简单、快速测定三磷酸腺苷结合盒转运子 1(ATP binding- cassettetransporter 1,ABC1)基因突变点 I82 3M的方法。方法 设计两种等位基因特异性引物 ,分别与 DNA双链的两条单链互补 ,其 3′端正好与单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism ,SNP)位点重合 ,由引物的 3′端控制着引物的延伸反应 ,根据延伸反应的长度确定等位基因的类型 ,并通过在引物的 3′端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。结果 人为引入错配碱能提高单核苷酸多态性分析的特异性 ;通过优化实验条件 ,用本室建立的双等位基因特异性扩增法 ,可测定人 ABCA1基因突变点 I82 3M的不同 SNP类型。结论 人工修饰双等位基因特异性引物扩增法可用于人基因组中单核苷酸多态性的快速测定 ,不需使用复杂仪器设备 ,便于推广使用。

格尔德霉素(GDA)能导致小麦基因组DNA多态性和甲基化修饰增加

刚露白的普通小麦(Triticum aestivum L.)种子用150μmol/L格尔德霉素溶液处理后,小麦根的生长受到抑制。随机扩增多态性DNA标记技术和双限制性内切酶酶切-随机扩增法检测显示,小麦根端分生细胞基因组DNA的多态性和甲基化比例均增加。本研究从分子生物学和表观遗传学水平探讨了格尔德霉素抑制小麦生长的机制。

广州地区2460例呼吸道感染患者7种呼吸道病原体RNA检测结果分析

目的通过检测7种呼吸道病原体RNA,了解广州地区呼吸道病原体的分布和流行情况。方法采用核酸双扩增法检测2019年3月至2020年2月广东省人民医院2460例呼吸道感染门诊和住院患者咽喉拭子中7种呼吸道病原体RNA,并对患者的性别、年龄、病原体的季节分布等进行统计分析。结果广州地区2640例呼吸道疾病患者7种呼吸道病原体RNA的总阳性率为8.46%(208/2460),阳性率最高的是呼吸道合胞病毒,阳性率为2.85%,其次为肺炎支原体和副流感病毒。女性患者肺炎支原体RNA阳性率明显高于男性患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。少年组呼吸道合胞病毒阳性率(3.93%)、副流感病毒阳性率(3.35%)、腺病毒阳性率(1.31%)在所有年龄组中最高,各年龄组间的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。4个季节的甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎支原体RNA的阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05),春季的阳性率高于其它季节。结论在广州地区呼吸道合胞病毒和肺炎支原体是引起呼吸道疾病的主要病原体,应在高发季节和易感人群中做好防治工作,通过核酸双扩增法检测呼吸道病原体RNA有助于准确分析广州地区呼吸道感染的病原学和流行病学特点,为临床用药提供合理诊断依据。

Trichostatin A能导致小麦基因组DNA改变及甲基化修饰

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用机制,本实验以组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A处理小麦根尖,通过随机扩增多态性DNA标记技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)和双限制性内切酶酶切-随机扩增法(Coupled Restriction Enzyme Digestion-Random Amplification,CRED-RA)进行探究的结果发现,与对照组相比,处理组10个随机引物的RAPD扩增条带出现83条多样性差异,多样性比例达到87.4%,同时处理组DNA甲基化比例增加.本研究证实Trichostatin A能使小麦基因组DNA发生改变,并出现了表观修饰,从而从分子和表观水平探讨了该抑制剂的作用机理.

两种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能评估研究

目的开展两种待考核试剂(RNA恒温扩增-金探针层析法、双扩增法)和参比试剂[实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time-polymerase chain reaction,qPCR)]的对比实验,评价待考核试剂的应用性能和有效性,能否满足临床检测要求。方法对2020-01-23~03-12日作者医院采集的269份样本,同时采用待考核试剂和参比试剂检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),以临床确诊/排除结果共同评价本次待考核试剂的临床试验结果。结果待考核试剂与参比试剂进行比对,灵敏度98.91%[95%置信区间(confidence interval,CI)(96.79%,100%)],特异性100%[95%CI(97.94%,100%)],总符合率99.63%[95%CI(98.90%,100%)],一致性Kappa值0.99;与临床确诊/排除结果进行比对,咽拭子、痰液、咽拭子+痰液的一致性Kappa值分别为0.90、0.92、0.92;总符合率分别为96.24%、96.39%、96.67%。结论两种SARS-CoV-2核酸检测试剂盒与参比试剂、临床确诊/排除结果比较,SARS-CoV-2检测符合情况良好,符合临床对上市产品的质量要求。