人酸性成纤维细胞生长因子双抗体夹心测定方法

用纯化的人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａＦＧＦ）免疫家兔，获得了兔抗ｈａＦＧＦ血清。另从含ｈａＦＧＦ单克隆抗体的小鼠腹水中纯化了ＩｇＧ。用纯化的单抗ＩｇＧ和多抗血清建立了ｈａＦＧＦ的双抗体夹心测定方法，检测水平可达０．２５ｎｇ／ｍｌ。用此方法测定了Ｎ端截断型ｈａＦＧＦ和牛酸性成纤维细胞生长因子（ｂａＦＧＦ），结果显示截断型ｈａＦＧＦ的检测灵敏度较低，ｂａＦＧＦ更低，提示单克隆抗体的抗原识别部位在ｈａＦＧＦ的Ｎ端附近。另外，肝素对ｈａＦＧＦ的检测有明显的影响，说明单抗的抗原识别部位与肝素的结合部位有关．

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

动物医院临床血清样品中干扰抗体的筛查及干扰消除

为了筛查动物医院临床血清样本中的干扰抗体以避免其实验室检测结果呈现假阳性,影响临床诊断,试验采用一种独立于物种的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法对来自于福建省部分地区动物医院接诊的犬、猫血清样本进行干扰抗体筛选和评估,用鸡IgY替换纯化小鼠IgG进行干扰抗体消除试验,并对干扰抗体阳性率与样本基本特征进行关联性分析。结果表明:在83份犬血清样本中,有19份样本为干扰抗体阳性,阳性率为22.9%;在81份猫血清样本中,有11份样本为干扰抗体阳性,阳性率为13.6%。经干扰抗体消除试验后,所有阳性血清样本中的干扰抗体均得到了有效消除。不同年龄、性别、绝育情况与品种犬之间的干扰抗体阳性率均差异不显著(P>0.05);不同年龄猫之间的干扰抗体阳性率显著差异(P<0.05),不同性别、绝育情况与品种之间的干扰抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。说明所检测的犬、猫血清样本中存在干扰抗体,用鸡IgY替换纯化小鼠IgG可对干扰抗体进行有效消除。

汉逊酵母宿主细胞蛋白抗体制备的研究

本实验优化了汉逊酵母宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)抗体的常规制备方法,并以此抗体为基础提高了双抗体夹心ELISA法检测宿主细胞蛋白残留量的灵敏度。相较于常规方法,本实验在免疫动物过程中加强了较弱免疫原性宿主蛋白的免疫效果,从而使检测结果更加接近真实值。结果显示,该方法制备的标准曲线R^2=0.996,最低检测限为3.906ng/m L。与商品化试剂盒的比较实验中,对同一样品的HCP检测残留量分别为0.0512和0.0185,本实验方法检测值高于商品化试剂盒的检测值。

Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50～1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%～117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。

贵州3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测与分析

应用DAS-ELISA法对从贵州省马铃薯种植区采集带症状的202份马铃薯叶片分别进行了PVX、PVY、PLRV 3种马铃薯病毒的检测。结果表明,3种马铃薯病毒在贵州马铃薯种植区表现出比较显著的田间症状,其病毒的发生与气候类型、种薯品种来源、种植方式存在相关性,并结合马铃薯实际生产对其病毒防治措施做了简要讨论。

丹参病毒病病原鉴定研究

目的 鉴定我国中草药丹参病毒病的病原及其种类。方法 从自然感染引起花叶、矮化、褪绿和斑驳的丹参植株上分离病毒病原 ,进行生物学接种、电镜观察、双抗体夹心酶联免疫吸附测定、逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析。结果 通过指示植物症状、电镜下病毒粒体形状和血清学反应发现病毒分离物与黄瓜花叶病毒有较近的亲缘关系 ,初步将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒。通过逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析 ,证明该病毒分离物为一个黄瓜花叶病毒新株系。结论 感染丹参的病毒病原为黄瓜花叶病毒 。

怀玉山高山马铃薯茎尖再生苗6种病毒的DAS-ELISA检测与分析

对怀玉山高山马铃薯茎尖再生苗6种病毒(马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯M病毒和马铃薯A病毒)进行了DAS-ELISA检测与分析,并比较不同茎尖脱毒方法的效率,旨在确定怀玉山高山马铃薯的病毒种类,并筛选出怀玉山高山马铃薯脱毒苗。结果表明,怀玉山高山马铃薯感染的病毒包括马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯M病毒和马铃薯A病毒6种。"单纯的茎尖培养"以及"茎尖培养→热处理→茎尖培养"只能脱除部分病毒,而"茎尖培养→热处理→茎尖培养→热处理→茎尖培养"可脱除全部6种病毒。本试验成功获得了脱毒效果较好的编号为5-1-2和6-4-1以及脱毒效果最好的编号为5-3-2和6-2-2的怀玉山高山马铃薯茎尖再生脱毒苗。本试验结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的工业化生产及其主粮化背景下高山马铃薯的产业化发展提供了技术支撑和理论依据。

镍接触工人中Cap43蛋白的过表达：一个潜在的筛查指标

目的通过检测钙激活蛋白43(Cap43)在镍接触工人尿液及血清中的蛋白表达情况,探讨Cap43表达在镍接触人群与非镍接触人群之间有无差异,及其表达高低与镍接触检体标本之间的关系。方法采用双抗夹心ELISA法检测150例镍接触工人[尿镍超标(>0.17μmol/ml)17例,尿镍未超标133例]及10例正常人群尿液及血清中Cap43的表达。结果尿液中Cap43的表达:尿镍超标组为(1.138±0.236)ng/ml,尿镍未超标组为(0.987±0.098)ng/ml,正常人群组为(0.609±0.012)ng/ml。血清中Cap43的表达:尿镍超标组为(2.4145±0.3475)ng/ml,尿镍正常组为(1.5614±0.5101)ng/ml,正常人群组为(1.2127±0.4135)ng/ml。结论Cap43表达与镍接触直接相关,尿中Cap43含量高低与血清中Cap43含量有正相关关系(r=0.7755,P<0.01),Cap43检测应以血清标本为宜,本实验结果为Cap43蛋白作为镍接触人群一个普查和疾病预防指标提供了有力的依据。

免疫增强及抑制因子在鼻咽癌中的表达及意义

目的检测免疫增强因子 Hsp27、Hsp70、Hsp90、IL-2、TNFα及免疫抑制因子 IL-10、TGFβ_1在鼻咽癌中的表达,探讨其在免疫治疗上的意义。方法应用 Western blot 检测 Hsp27、Hsp70、Hsp90在鼻咽癌及鼻咽炎症活检组织中的表达,用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测鼻咽癌、鼻咽炎症及正常人血清中 IL-2、TNFα、IL-10、TGFβ_1的表达水平,了解机体的免疫状态。结果鼻咽癌组织中Hsp27较鼻咽炎症组织高表达(P<0.05),Hsp70、Hsp90表达无明显差异,鼻咽癌血清中 TNFα(P<0.01)、TGFβ_1(P<0.01)水平较正常及鼻咽炎症升高,IL-10表达明显降低(P<0.01),IL-2表达无明显变化(P=0.425)。结论根据鼻咽癌患者免疫增强及抑制因子表达情况,可以应用小剂量的 IL-2,TGFβ单克隆抗体,Hsp 多肽复合物疫苗来辅助鼻咽癌的治疗。

海南省辣椒、番茄病毒病病原DAS-ELISA定性检测

辣椒和番茄是海南省重要的经济作物,但病毒病的发生导致严重减产。2013-2014年,在全省范围内采集了253份辣椒病毒病样品和289番茄病毒病样品,采用DAS-ELISA对7种主要病毒及病毒的相对含量进行了测定。结果显示,辣椒病毒病的总体检出率为59.68%,CMV的检出率最高,为41.11%,存在7种复合侵染类型,复合侵染率为30.83%,优势毒源为CMV和TMV。番茄病毒病的总体检出率为44.64%,TYLCV的检出率最高,为22.84%,存在10种复合侵染类型,复合侵染率为15.57%,优势毒源为TYLCV和CMV。样品相对含量测定显示,在辣椒中CMV的相对含量最高,BBWV的含量最低;在番茄中TYLCV的相对含量最高,BBWV的含量最低;辣椒样品中除CMV含量高于番茄外,其他病毒的含量均低于番茄。

抗柯萨奇病毒A组2型单克隆抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立

目的制备抗柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)单克隆抗体(单抗),建立CV-A2抗原检测方法。方法用纯化后的CV-A2全病毒颗粒免疫小鼠,筛选获得抗CV-A2单抗。建立CV-A2抗原检测方法,确定线性范围,对其准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。用ELISA检测病毒颗粒纯化过程中样品的抗原含量。结果制备了高效价的抗CV-A2单抗并建立ELISA抗原检测方法,检测范围为5.00~320.00 ng/ml。高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率在89.58%~104.78%之间。重复性验证变异系数分别为2.10%、2.47%、6.18%。中间精密度验证变异系数分别为2.89%、2.69%、1.94%。耐用性验证回收率在84.26%~114.21%之间。包被微孔板于37℃放置3 d,样品回收率在90.31%~103.11%之间。专属性验证结果显示该方法只识别CV-A2抗原,与其他抗原均无交叉反应。结论建立并验证了CV-A2 ELISA抗原检测方法,可应用于病毒纯化过程中样品的抗原检测,还可应用于含CV-A2的手足口病多价疫苗的CV-A2抗原含量检测。

抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用

目的 制备抗甲型肝炎病毒（hepatitis A virus,HAV）卵黄免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk,IgY）,并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法 用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAVIgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果 亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78豫;效价最高为1：16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71（enterovirus 71,EV71）均不反应;纯化的抗HAV IgY在25～70℃条件下处理15 min及经pH 3.0～10.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62～2 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论 制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。

金黄色葡萄糖球菌肠毒素C2改构蛋白大鼠药动学研究

目的研究金黄色葡萄糖球菌肠毒素C2改构蛋白(2M-118)在大鼠体内单次和多次给药后的药动学特征。方法24只大鼠随机分为3组,每组8只,雌雄各半,分别单次iv低、中和高剂量(1、2和4 mg/kg)2M-118,高剂量组大鼠于单次给药后,继续每天给药1次,共给药8次。于给药前(0 h),首次及末次给药后5、10、20、30、45 min和1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0 h采集眼静脉丛全血约0.5 mL,制备血清。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清药物浓度,采用DAS 3.2.8药动程序计算药动学参数。结果大鼠单次iv 2M-118后,在1~4 mg/kg剂量内,峰浓度(Cmax)、初始浓度(C0)和药时曲线下面积(AUC)均与剂量呈正相关;消除相半衰期(t1/2Z)随剂量递增明显延后,平均t1/2z分别为0.24、0.60和1.18 h;表观分布容积(Vz)随剂量递增而增大;各剂量组的清除率(CLz)较为一致。与同剂量(4 mg/kg)单次给药相比,大鼠多次给药后的主要药动学参数基本保持一致,体内药物无蓄积倾向。结论大鼠单次iv 2M-118后,在1~4 mg/kg剂量内,体内暴露量与剂量呈正相关,其清除可能呈现非线性动力学特征;单次与多次iv给予相同剂量2M-118后,药动学行为特征基本一致,无明显药物蓄积。