双抗体夹心酶联免疫吸附法检测鱼糜制品中鸡蛋卵白蛋白

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附(sandwich enzyme linked immunosorbent assay,sELISA)法检测鸡蛋卵白蛋白(ovalbumin,OVA)的方法,组装定量检测鱼糜制品中OVA含量的ELISA检测试剂盒。方法确定各步骤反应时间,使用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度,建立检测方法并对其性能进行评价。结果反应最佳条件为:抗原孵育20 min,检测抗体孵育20min,酶促反应显色10 min。兔抗OVA抗体为捕获抗体,工作质量浓度为1μg/mL,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗OVA抗体为检测抗体,1:5000(V:V)稀释。采用四参数逻辑曲线拟合标准曲线,所建立sELISA方法的检测范围为8.5~200.0 ng/mL,检出限为3.5 ng/mL,定量限为8.5 ng/mL。批次内和批次间的变异系数分别为2.31%~4.58%和6.06%~12.23%;鱼糜基质中的回收率为80%~130%;测得28种常见食物样品中4种样品的交叉反应率小于0.002%;试剂盒在4℃保存6个月期间,标准品检测结果的变异系数为4.29%~18.91%。结论建立的方法快速、灵敏、准确、稳定性好,可用于鱼糜制品中鸡蛋OVA的定量检测。

犬粪便棘球绦虫抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法建立与应用

目的研究双抗体夹心酶联免疫吸附检测犬粪便棘球绦虫虫体抗原的方法并评价其在实际工作中的应用价值。方法实验犬12只，分实验组和对照组，实验组用活化绵羊源原头蚴（G1型）作人工感染；感染后0～8周内收集粪便，56d宰杀实验犬，收集成虫；制备成虫抗原和虫体代谢／分泌抗原，蛋白酶K处理抗原并分别免疫成年绵羊和新西兰白兔；绵羊抗血清用80％饱和硫酸铵沉淀、透析，兔抗血清过IgG亲和层析柱，分别获得纯化抗体；观察犬粪便在PBS液中-80℃冷冻3d或在含1％Formalin的PBS液中70℃～80℃加热8h的处理方法对检出结果的影响。运用该方法对四川省甘孜县达通玛区4个乡的580只家犬吡喹酮每6月一次驱虫前后的粪抗原进行监测。结果试验系统的敏感性为92．3％，特异性为80％；粪抗原从感染后的第2～3周可检出；两种样品处理方法都可以灭活虫卵但不影响检出效果；检测方法可同时用于对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染的诊断；达通玛区家犬粪抗原阳性率从2000年的50％下降到2005年的17％。结论检测方法具有较高的特异性和敏感性；推荐粪便用加热的方法处理可以灭活虫卵以防止生物污染；该方法可以在基层推广应用。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测布氏菌抗原的实验研究

目的 建立检测布氏菌抗原特异、敏感和快速的试验方法。方法 在制备高滴度布氏菌抗体辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上 ,建立检测布氏菌抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (DAbS -ELISA) ,包括常规DAbS -ELISA及快速DAbS -ELISA。用建立的两种DAbS -ELISA法对布氏菌菌体抗原及可溶性抗原进行有关其特异性及敏感性对比观察 ;同时对模拟的这些抗原污染的饮用水标本进行对比观察。结果 常规DAbS -ELISA检测布氏菌 5 44A、16M、13 3OS及 10 4M的菌体抗原以及布氏菌 16M可溶性抗原的敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190万菌 /ml、2万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;用快速DAbS -ELISA法的敏感性分别为 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml;同时用这两种DAbS -ELISA检测上述抗原污染的饮用水标本其敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;以及 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml。而且这两种DAbS -ELISA法检测不含布氏菌抗原的所有对照均为阴性反应。结论 双抗体夹心酶联免疫吸附试验是检测布氏菌抗原的特异、敏感、快速和适用的试验方法。

甜菜丛根病的双抗体夹心酶联免疫吸附测定

对甜菜丛根病毒采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(Double antibody sandwich assay,DAS-ELISA)法进行了检测,并对测定方法及检测结果进行了分析讨论。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测杏仁过敏原苦杏仁球蛋白

提取中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁球蛋白,分别制备兔和鼠多克隆抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法。结果表明:对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为(6.36±1.02)μg/L;对中国苦杏仁及美国大杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限分别为(12.11±1.70)μg/L和(18.95±1.52)μg/L,且与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛乳中杏仁过敏原的检测,苦杏仁球蛋白的添加回收率为78.94%～125.15%,且相对标准偏差均低于5.81%。

改良双抗体夹心酶联免疫法测定重组人活性蛋白C含量的研究

研究用ELISA法直接定量检测细胞培养液中的重组人活性蛋白C(rhAPC)。用改良双抗体夹心酶联免疫检测法进行定量分析。用棋盘滴定法对包被抗体、反应一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗的适宜工作浓度进行了选择,并对实验条件进行优化,参考品标准曲线线性相关性较好。改良双抗体夹心酶联免疫检测法可用于直接定量分析细胞培养液中的rhAPC水平。

双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测诺如病毒

诺如病毒属于杯状病毒科，是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原，广泛分布于世界各地。虽然诺如病毒胃肠炎是温和的、自限性的疾病，但是它发病率高，感染广泛，导致住院和死亡人数的增加。危害人类的诺如病毒可分为GGI和GGII两个遗传组（genogroup），近来的研究表明，GGI和GGII至少分别由14和17个遗传型（genotype）组成。目前全世界范围内流行的诺如病毒毒株绝大部分是GGII组，GGI在我国很少见，因此，GGII组应为诺如病毒的主要防控对象。

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明:所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^(-1),最佳线性范围为25~1 600 ng·mL^(-1),批内变异系数为1.65%~5.62%,批间变异系数为3.66%~6.81%,可检测出麻鸭各组织中ACE2含量。传染性浆膜炎组白鸭以及健康鸭心脏、肝脏等组织样品ACE2含量或表达存在差异,心脏组织中显著升高或上调;鸭传染性浆膜炎组心脏中ACE2 mRNA水平显著上调,肝脏组织中ACE2 mRNA水平升高不明显。采用该ELISA方法对不同畜(大鼠、猪、羊)、禽(鸭、鸡、鹅)的不同组织中ACE2进行了定量测定,证实该方法在不同畜禽上存在较大种属差异,仅适用于家禽ACE2的定量检测。综上,该研究成功建立了鸭ACE2检测的双抗体夹心ELISA方法,可用于禽类样品中ACE2的快速定量检测。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测粉尘螨2组变应原方法的建立

尘螨是最常见、最主要的过敏性疾病变应原。螨体中最主要的致敏成分是1组和2组变应原（Der1、Der2）。酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测尘螨变应原含量应用最广泛的方法．但国内定量检测尘螨变应原的方法学研究鲜见报道。本研究用重组粉尘螨2组Der f 2（rDer f 2）．制备免疫血清，建立一种以辣根过氧化物酶系统为基础的双抗体夹心ELISA，以快速检测Der f2．现报告如下。

白色念珠菌烯醇化酶抗原双抗体夹心法的建立及应用

目的建立定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的双抗体夹心法,为后续定量检测念珠菌性阴道炎患者阴道分泌物中的烯醇化酶抗原提供方法学基础。方法用方阵滴定法确定最佳包被抗体浓度和最佳酶标二抗浓度,建立检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的ELISA法,用该法检测白色念珠菌标准菌株SC5314培养上清中烯醇化酶抗原的浓度,初步探索应用于诊断外阴阴道念珠菌病。结果最佳包被抗Eno单抗浓度为4.15μg/mL;酶标二抗HRP标记的抗烯醇化酶多抗最佳稀释倍数为1∶1000。在第12小时时白色念珠菌培养上清中的烯醇化酶抗原开始检出,随着培养时间的延长,其上清中Eno抗原的浓度也随着逐渐增高,第48小时时达到峰值后趋于稳定。阴道分泌物上清中烯醇化酶抗原浓度随着真菌培养菌落计数的增加其浓度也在增加,有很好的相关性。结论成功建立了定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的双抗体夹心ELISA方法,可应用于评价念珠菌性阴道炎患者阴道分泌物中的烯醇化酶抗原的水平。

双抗体夹心酶联免疫吸附法测定人干扰素α-2b在豚鼠体液中的含量

目的：建立双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）快速测定豚鼠体液中人干扰素α-2b的浓度,为其新制剂的体内研究奠定基础。方法：对双抗体夹心ELISA法用于豚鼠内耳外淋巴液、脑脊液和血清中人干扰素α-2b浓度的测定进行了方法学考察;豚鼠静脉注射人干扰素α-2b后采集各体液,采用该法测定其中药物浓度。结果：该法在31.25-1 000 pg.mL-1内线性关系良好,板内精密度小于7.8%,板间精密度小于11.9%,各体液中的药物回收率为91%-111%。静脉给药后,药物在内耳外淋巴液和脑脊液中的浓度远远低于血清。结论：该法简单、快捷、灵敏,适用于人干扰素α-2b在豚鼠体内的含量测定及药动学研究。

酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG

〔目的〕建立检测牛初乳素为原料的保健食品中免疫球蛋白IgG的常用酶联免疫双抗体夹心法。〔方法〕分离纯化小牛血清中IgG,以牛IgG免疫新西兰兔,获得抗牛IgG的血清,分离纯化,制备兔抗牛IgG。〔结果〕1000ng/孔兔抗牛IgG饮被酶联板,3倍比稀释牛IgG,夹心法检测。〔结果〕在牛IgG0.031mg/ml-2.50mg/ml范围,浓度与吸光度值线性相关,方程为:y=0.358+0.767x,相关系数为r=0.995,当添加50mmIgG时,回收率为88.4％,变异系数为6.1％。〔结论〕该方法具有特异性强、快速、灵敏和分析成本低等特点。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验法在肺结核患者血清HMGB1水平检测中的应用

目的应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺结核患者抗结核治疗前后血高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平变化研究,以探讨其临床诊断意义。方法采用ELISA法检测患者血清HMGB1的水平,同时测定活动组患者在抗结核治疗前、治疗后1个月、治疗后3个月及30例好转组的血清HMGB1水平。结果活动组患者比对照组、稳定组的血清HMGB1浓度水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05),稳定组患者比对照组的血清HMGB1浓度水平升高,但差异无统计学意义(P>0.05);治疗后1个月、治疗后3个月的血清HMGB1浓度水平比治疗前均有所降低,差异无统计学意义(P>0.05),但其中治疗3个月后有30例活动性肺结核患者病情好转(好转组)比治疗前显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论动态监测肺结核患者血清HMGB1水平,对活动性肺结核的辅助诊断及疗效观察有重要意义。

白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测白念珠菌烯醇化酶(enolase,Eno)的双抗体夹心ELISA法,并试用于几种真菌培养上清液的检测。方法将抗白念珠菌Eno单抗作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗Eno抗体作为检测抗体,用方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体浓度,建立检测Eno的ELISA法,对方法的精密度、特异性、最低检测限等指标进行评价。用该法检测白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等不同真菌培养上清中Eno水平。结果 Eno浓度为20 ng/mL和5 ng/mL时,批内和批间变异系数(CV)分别为6.61%、9.19%和6.98%、13.81%;最低检测限为1.25ng/mL。本法可从白念珠菌37℃培养24 h后的上清中检出Eno,Eno含量与白念珠菌菌丝含量呈正相关。本法对近平滑念珠菌有微弱交叉反应,与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。结论建立的检测白念珠菌Eno的双抗体夹心ELISA方法有较好的特异性,可用于评价Eno检测在侵袭性白念珠菌感染中的诊断价值。

黄瓜绿斑驳花叶病毒病快速检测法与酶联免疫双抗体夹心检测法的比较及其在生产上的应用

采用快速检测法(浙江大学和安德珍各自生产的试剂盒)和酶联免疫双抗体夹心法对棚栽嫁接西瓜疑似感病植株叶片和显症植株叶片进行黄瓜绿斑驳花叶病毒检测,结果发现,疑似感病叶片中,阳性率:DAS-ELISA法86.36%>浙大快速检测法59.09%>安德珍快速检测法34.09%,DASELISA法与快速检测法之间的阳性率差异极显著(χ~2=25.03,P<0.01),与浙大快速检测法符合率72.72%,与安德珍快速检测法符合率为47.72%,2家快速检测法之间的阳性率有显著性差异(χ~2=4.57,P<0.05);显症病叶中,阳性检出率浙大快速检测法高于安德珍快速检测法,当样品在冰箱中保存后,快速检测法的阳性检出率会下降,影响检测结果。

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D450 nm≥0.161作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月。用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%。表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测。

双抗体夹心斑点金免疫渗滤法检测血吸虫循环抗原的现场应用

目的 探讨双抗体夹心斑点金免疫渗滤法 (S- DIGFA)在现场的应用价值。方法 在原已建立的以抗 2 6 k Da GST基因重组蛋白多克隆抗体为捕获抗体兼测示抗体的 S- DIGFA的基础上 ,应用该法检测血吸虫病中度流行区和传播阻断地区人群的血清共 1388份 ,并以双抗体夹心EL ISA(S- EL ISA)作对照。结果 用 S- DIGFA和 S- EL ISA平行检测血吸虫病中度流行区人群血清30 0份 ,阳性检出率分别为 15 .7%和 17.3% ;两法检测血吸虫病传播阻断地区人群血清 10 88份 ,阳性检出率分别为 3.9%和 3.7%。结论 S- DIGFA检测循环抗原可在现场扩大应用和作血清流行病学调查。