禽腺病毒4型Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白的单克隆抗体并建立Fiber-2蛋白的定量检测方法。本研究将原核表达的Fiber-2蛋白免疫BALB/c雌鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过免疫印迹、间接免疫荧光和抗体相加试验筛选杂交瘤细胞株;以制备的单克隆抗体为捕获抗体和酶标检测抗体,通过优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,建立特异性检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法。结果:本研究成功筛选到3株能够稳定传代的杂交瘤细胞株1H2、2A9和3E1,其分泌的抗体均与FAdV-4全病毒具有良好的反应性,可识别不同抗原表位;进一步发现,以1H2为捕获抗体、2A9为酶标检测抗体,能够建立检测Fiber-2蛋白的ELISA方法;该方法具有良好的重复性,批内重复及批间重复试验变异系数均小于10%;敏感性高,Fiber-2蛋白检测限为0.078 ng/μL;特异性好,不与FAdV-4的其他结构蛋白及鸭腺病毒3型的Fiber-2蛋白发生反应。综上,本研究成功制备了3株Fiber-2蛋白单克隆抗体,并建立了定量检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法,为后续FAdV-4基础研究和Fiber-2亚单位疫苗研究奠定了物质基础。

基于血凝素蛋白特异性抗体的H7亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法建立

目的基于H7亚型流感病毒,制备针对于HA抗原的单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测体系,为其在流感病毒快速检测试剂研发中提供技术储备。方法用H7亚型禽流感病毒HA重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤技术制备HA特异性单克隆抗体,筛选可在双抗体夹心ELISA技术平台上使用的配对抗体,初步探索该ELISA体系的检测特异性、敏感性和广谱性。结果共制备出6株HA特异性单克隆抗体,并成功筛选出捕获抗体8B11-C9及检测抗体7C3-G5的最佳配对。该双抗体夹心体系对HA重组蛋白的检测灵敏度可达到1.56 ng/mL,能有效检测出不同宿主来源的H7亚型流感病毒,与其他亚型流感病毒无交叉。结论成功制备出H7亚型流感病毒HA单克隆抗体,建立了H7亚型流感病毒特异性的双抗体夹心ELISA检测方法,为其快速检测试剂研发奠定了基础。

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明:所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^(-1),最佳线性范围为25~1 600 ng·mL^(-1),批内变异系数为1.65%~5.62%,批间变异系数为3.66%~6.81%,可检测出麻鸭各组织中ACE2含量。传染性浆膜炎组白鸭以及健康鸭心脏、肝脏等组织样品ACE2含量或表达存在差异,心脏组织中显著升高或上调;鸭传染性浆膜炎组心脏中ACE2 mRNA水平显著上调,肝脏组织中ACE2 mRNA水平升高不明显。采用该ELISA方法对不同畜(大鼠、猪、羊)、禽(鸭、鸡、鹅)的不同组织中ACE2进行了定量测定,证实该方法在不同畜禽上存在较大种属差异,仅适用于家禽ACE2的定量检测。综上,该研究成功建立了鸭ACE2检测的双抗体夹心ELISA方法,可用于禽类样品中ACE2的快速定量检测。

甲型肝炎病毒抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的:建立快速检测甲型肝炎病毒(HAV)抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法:用HAV多克隆抗体和HAV单克隆抗体酶结合物建立双抗体夹心ELISA法,检测HAV抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性(标准曲线)、准确度、精密度、灵敏度验证,对不同生产厂家生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)与不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品进行适用性检测。结果:HAV多克隆抗体的最佳包被浓度为8μg/mL,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000,封闭剂为1%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围0.546 875~17.500 000 IU/mL,R^(2)> 0.99;准确度验证回收率80.1%~123.7%;精密度验证变异系数<8.3%。检测不同厂家的HAV疫苗(人二倍体细胞)和不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品呈良好的剂量依赖效应。结论:建立了适用于HAV抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于不同毒株生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)检测,可用于甲肝病毒收获液、浓缩液、纯化液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。

传染性胰坏死病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测,结果双抗体夹心法与RT-PCR法检测符合率为97%,表明本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测IPNV具有较高的敏感性和特异性,可用于IPNV的病原学检测。

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果,抗体的最佳包被量为150μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶200;封闭液为50mL/L的兔血清;待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃120min;底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测,结果,阳性检出率为42.6%。

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D450 nm≥0.161作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月。用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%。表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测。

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法。该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性。与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P>0.17为阳性判定标准。应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%。

猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;ELISA的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbs）为基础，建立检测膦丝菌素乙酰转移酶（the phosphinothricin acetyltransferase,PAT）的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因（blalaphos resistance gene）bar，并与表达载体pET28a构建重组质粒，诱导表达产生外源性PAT蛋白；以纯化后的PAT蛋白为免疫原，制备mAbs，建立双抗体夹心ELISA方法，并与PCR检测方法进行比较，确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其有效检测范围为3.125～50 ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测，根据阴阳性判定值OD450〉0.210，检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份，以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份，2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法，可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈。单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法。用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体。经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性。为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法。兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2000;检测系统最佳稀释度为1:4000。结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。

牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型（BPIV3）双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）与兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1：25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为103TCID50。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法。用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应。攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV。该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具。

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗。选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法。用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性。用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%。该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具。

柱状黄杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测柱状黄杆菌,本研究以纯化的柱状黄杆菌单克隆抗体为捕获抗体,以多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测法。最佳的方案为用0.08μg/孔纯化的单克隆抗体4℃包被过夜,30g/L牛血清白蛋白37℃封闭90min,多克隆抗体的工作浓度为0.11μg/孔,检测抗原、多克隆抗体、酶标抗体均为37℃作用1h,显色15min后终止反应,当D492nm值≥0.776且P/N≥2.1时判定为阳性。该方法特异性强,与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌等水产病原菌均无交叉反应。最低检测剂量为1×103 CFU。本研究首次建立了检测柱状黄杆菌的双抗体夹心ELISA方法,经验证该方法特异性强、灵敏度高。

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。

猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用

为建立猪附红细胞体双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗猪附红细胞体单克隆抗体为捕获抗体,兔抗猪附红细胞体多克隆抗体为检测抗体,优化工作条件,建立猪附红细胞体DAS-ELISA检测方法。结果显示:该方法的最佳工作条件为:捕获抗体包被浓度为5.42 g/mL,检测抗体浓度为6.84 g/mL,酶标二抗的稀释倍数为1∶2000;判定标准为:当检测样品OD492>0.290为阳性;该方法与弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒等常见猪病原微生物均无交叉反应,特异性好,敏感度可达3.25 mg/L,其重复性变异系数均小于10%;平行检测68份猪临床样品,DAS-ELISA检测的阳性率为29.4%,比血涂片染色镜检阳性率(19.1%)高10.3%。本研究所建立的猪附红细胞体DAS-ELISA检测方法可以作为猪附红细胞体的快速检测方法。

弧菌融合蛋白TDH-VVC-VMHA双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为提高食品中副溶血弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌毒素初筛的速度与效率,建立了双抗体夹心ELISA检测方法。以融合蛋白TDH-VVC-VMHA包涵体为抗原免疫豚鼠,采用豚鼠抗融合蛋白免疫血清为包被抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗豚鼠IgG为标记抗体,应用棋盘滴定法确定ELISA的最适条件。结果表明,所建立的方法与副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌的培养物上清有较明显的阳性反应,与绿脓杆菌、金黄色葡菌球菌、李氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等5种非弧菌属食物中毒菌培养物上清未见交叉反应,与溶藻弧菌、河流弧菌和麦氏弧菌等3种弧菌培养物上清也未见交叉反应。这说明,该方法可以用于食品中副溶血弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌毒素的快速同步免疫学检测。

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。