加工食品中花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定的前处理方法探究与改进

目的构建一种可配合花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒实现对于加工食品中花生成分可靠检测的高质量样品前处理方法。方法对9种不同pH的提取缓冲液提取未处理、湿热处理、干热处理花生蛋白效果进行比较分析以确定最优提取缓冲液类型。而后,将吐温-20、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)以单独或组合添加的方式加入上一步获得的最优提取缓冲液中,提取3组花生蛋白,并对提取效果与夹心ELISA试剂盒检测花生蛋白回收率进行比较分析以确定最优添加剂配方。结果最终确定添加0.2%SDS和0.1%吐温-20的碳酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 9.6)为最优提取缓冲液。向碳酸盐缓冲液中加入SDS、吐温-20较好地提升了花生蛋白的提取率和回收率,将湿热处理花生蛋白回收率提高了2倍以上。结论本研究实现了对商业加工食品中花生成分的可靠检测,为推动过敏原信息在食品标签的准确标注提供了技术支撑,也为相关研究提供了参考。

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。

酶联免疫吸附分析双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起5周岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原体.目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的7项呼吸道病毒检测试剂盒,但其价格昂贵,且需荧光显微镜辅助诊断,不利于在基层医疗机构中推广,国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测.为此建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂,并以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测为参比,同时使用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床鼻咽抽吸物(NPA)样本进行检测.ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%和74.14%,特异度分别为100%和96.30%,Kappa值分别为0.787 1和0.689 5,两者均与RT-PCR检测结果具有高度一致性.此外,将ELISA双抗夹心法与免疫荧光法比较,两者无显著差异(p>0.05).综上,ELISA双抗夹心法操作简便,特异性高,有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断.

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测布氏菌抗原的实验研究

目的 建立检测布氏菌抗原特异、敏感和快速的试验方法。方法 在制备高滴度布氏菌抗体辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上 ,建立检测布氏菌抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (DAbS -ELISA) ,包括常规DAbS -ELISA及快速DAbS -ELISA。用建立的两种DAbS -ELISA法对布氏菌菌体抗原及可溶性抗原进行有关其特异性及敏感性对比观察 ;同时对模拟的这些抗原污染的饮用水标本进行对比观察。结果 常规DAbS -ELISA检测布氏菌 5 44A、16M、13 3OS及 10 4M的菌体抗原以及布氏菌 16M可溶性抗原的敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190万菌 /ml、2万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;用快速DAbS -ELISA法的敏感性分别为 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml;同时用这两种DAbS -ELISA检测上述抗原污染的饮用水标本其敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;以及 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml。而且这两种DAbS -ELISA法检测不含布氏菌抗原的所有对照均为阴性反应。结论 双抗体夹心酶联免疫吸附试验是检测布氏菌抗原的特异、敏感、快速和适用的试验方法。

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的:制备针对嗜肺军团菌血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。方法:用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果:研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM(2株)、IgG3(1株)和IgG1(5株);利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2.6×105cfu/mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论:制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心ELISA检测方法。

榛子过敏原双抗夹心酶联免疫吸附方法的建立及应用

目的建立榛子过敏原双抗夹心酶联免疫吸附法(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,sELISA)快速检测食品中微量榛子的方法。方法对两株抗体进行配对,确定捕获抗体和检测抗体,利用棋盘法确定捕获抗体、检测抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG(horseradish peroxidase-IgG,HRP-IgG)的最佳稀释浓度,然后对各工作步骤的孵育时间进行优化,并应用于实际食品的检测。结果使用兔抗作为捕获抗体,鼠抗作为检测抗体,兔抗血清稀释度为1:10000(V:V)、鼠抗血清稀释度为1:10000(V:V)、HRP-兔抗大鼠稀释度为1:20000(V:V)。各步骤最佳反应时间为抗原孵育30 min、检测抗体孵育30 min、酶标二抗孵育45 min及四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)显色8 min。此方法的线性回归方程为Y=0.4504 ln(X)+2.1194,r^(2)=0.9934,定量限为10 ng/mL、检出限为0.1 ng/mL。该方法特异性强,仅与核桃产生轻微的交叉反应,在面包、酸奶和咖啡基质中的回收率在80%到120%之间,批内、批间变异系数均小于15%。结论本方法具有较高的灵敏度和特异性,适用于商业加工食品中榛子残留的快速、准确检测。

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的:建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I(staphylococcal enterotoxin I,SEI)的双抗夹心酶联免疫吸附方法(double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)。方法:利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔Ig G(Ig G/HRP)的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果:抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液(p H 7.4)为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x+0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论:本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。

转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究

将克隆到的pat基因构建原核表达载体pET30（＋）-pat并在大肠杆菌中进行表达，分离纯化得到高纯度pat蛋白。用所得到的pat蛋白制备了兔多克隆抗体和鼠单抗2F6。多抗效价〉8000，单抗效价为5×10^4；单抗为IgGl类，轻链为，（型。基于抗pat蛋白单克隆抗体和兔多克隆抗体建立了双抗夹心酶联免疫分析方法（SandwichELISA）。检测范围为1．6～100μg／L，线性回归方程y=0．6914x-2．572，决定系数为0．9951。用所建立的方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花品种叶片中pat蛋白的含量，其中转基因抗虫棉中的3个品种检测出pat蛋白，其余均未检出pat蛋白。

鸡血浆纤维连接蛋白的提纯及酶联免疫吸附检测方法的建立

利用纤维连接蛋白 (FN)与明胶特异结合的特点 ,用明胶亲和层析结合电泳裁胶的方法提纯鸡血浆FN并制备了兔抗鸡FN抗血清。纯化的FN经凝胶电泳鉴定为一条蛋白带且与人FN在同一位置上 ,亚单位分子量约 2 3 0KDa ;经免疫鉴定 ,提纯鸡血浆FN与兔抗人FN抗体有交叉反应性。用兔抗鸡FN抗体包被捕捉抗原 ,建立了检测鸡血浆FN的双抗体酶联免疫吸附法(ELISA) ,此法具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点 ,适用于鸡血浆FN的检测。鸡血浆FN的提纯及其检测方法的建立 ,为FN在兽医领域的进一步研究和应用奠定了基础。

不同酶联免疫吸附试验检测系统评价方法探讨

目的探讨不同酶联免疫吸附试验(ELISA)检测系统的评价方法,以保证同一采供血机构实验室内多套检测系统检测结果的稳定性、准确性和一致性。方法稳定性评价,采用A、B两套ELISA检测系统同时检测同一个弱阳性标本,连续20次,比较两套系统变异系数(CV值)大小。准确性和一致性评价,A、B两套系统同时检测室间质评阳性样本,根据本试剂组反馈结果的吸光度/临界值比值(S/CO值)均值(x)、标准差(SD),以x作为参考结果分别计算每个样本A、B系统结果的S/CO值标准差指数SDI1、SDI2;分析两套系统检测结果之间的差异。结果 A、B检测系统CV值分别为6.5%和5.3%;A系统结果中有3个标本︱SDI1︱大于2,其他结果均小于2,且无趋势性偏移;B系统结果︱SDI2︱均小于2,且无趋势性偏移;两套系统检测结果之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论两套检测系统稳定性较好,检测结果均处于可受控状态,且具有较好的一致性。

酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用

目的:建立一种简便、微创的血清肝素酶酶联免疫吸附(ELISA)定量检测方法,并对肿瘤患者和正常人血清肝素酶进行比较,初步探讨血清肝素酶水平与肿瘤发生、发展的关系。方法:选择鼠抗人肝素酶单克隆抗体和兔抗人肝素酶多克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法,并利用此方法检测健康献血者和肿瘤患者血清中的肝素酶水平。结果:组内数据稳定,可重复;肿瘤患者血清中肝素酶D450nm值高于健康献血者。结论:所建立的血清肝素酶ELISA检测方法灵敏、高效,可用于肿瘤的辅助诊断。

夹心酶联免疫吸附试验检测人表皮生长因子的方法建立及其应用研究

目的:建立临床适用的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)酶联免疫检测方法,探讨EGF在临床常见肿瘤患者血清中的含量变化规律。方法:采用EGF单抗包被酶标板,兔抗EGF多抗为二抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体建立夹心法ELISA检测临床常见肿瘤患者及健康体检人群的血清EGF含量。结果:建立的EGF酶联免疫吸附法最小检测限达15.6ng/L,批内精密度为8.7%,批间精密度为11.6%,平均回收率为94.7%,符合临床检测要求。血清EGF含量在31名正常人为(1.305±0.382)ng/mL,24名乳腺癌病人术前值为(0.729±0.347)ng/mL,术后为(0.711±0.332)ng/mL,17名结直肠癌病人术前为(0.678±0.311)ng/mL,术后为(0.658±0.298)ng/mL,19名胃癌病人术前为(0.598±0.224)ng/mL,术后为(0.614±0.257)ng/mL。各肿瘤组患者血清EGF水平较健康对照组明显降低(P<0.01)。结论:建立了适用于临床检测的EGF酶联免疫检测方法,肿瘤患者血清中EGF含量较健康对照组明显下降,该检测方法的建立为进一步探讨肿瘤的发病机制提供了有效的手段。

盐酸克伦特罗残留酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的研究

建立了间接ELISA检测盐酸克伦特罗的方法，并对其参数进行了分析计算。在该检测方法中，抗盐酸克伦特罗（CL）抗体最适稀释度为1：1000，羊抗兔酶抗体（HRP—IgG）的最适稀释度为1：1500。该检测方法的检测灵敏度可达0．1046μg／L，生物检测限为1．452μg／L，线性检测范围为7．26～90．75μg／L。

动物源性食品安全快速检测及酶联免疫吸附方法的应用

本文介绍了动物源性食品安全的定义和存在的主要问题,重点阐述了酶联免疫吸附方法(ELISA)在兽药残留、农药残留、动物疫病、微生物、动物毒素快速检测中的应用。

酶联免疫荧光法与双抗夹心酶联免疫吸附法测定屋尘螨组分IgG4的比较

目的运用酶联免疫荧光法（UniCAP法）和双抗夹心酶联免疫吸附法（Fooke法）分别测定经特异性免疫治疗（SIT）的患儿血清sIgG4水平,评价两种免疫定量检测方法的相互关系。方法对45例成功进行皮下SIT的患儿血清分别用UniCAP法和Fooke法检测治疗前、治疗6~8个月后、治疗12~14个月后sIgG4水平。结果与治疗前相比较,在治疗6~8个月和治疗12~14个月后,UniCAP法检测45例患儿血清sIgG4水平全部均有不同程度升高,Fooke法在SIT后6~8个月和12~14个月后分别有40和43例患儿sIgG4水平有不同程度升高,但两种方法检测sIgG4结果升高幅度有差异。结论对于sIgG4测定,SIT后,Uni CAP法比Fooke法测定值升高的幅度更明显。

双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析

目的探析双抗夹心法酶联免疫吸附试验中牛血清清蛋白封闭,吐温20及浓度,样品与检测抗体的加样方式及孵育温度对酶联免疫吸附试验检测结果的影响。方法双抗夹心法酶联免疫吸附试验检测人白细胞介素(IL)-1Ra细胞因子作为模型,检测封闭条件,吐温20及其不同浓度,样品与检测抗体分开孵育及共同孵育,酶联孵育温度对标准品浓度与OD值关系的影响。结果酶联免疫吸附试验不封闭、洗液吐温浓度为0.05%且孵育温度为37℃的R^2=0.995 7;BSA封闭的R^2=0.981 1;洗液中吐温浓度0.005%时R^2=0.991 5,0.5%时R^2=0.9868;样品和检测抗体一同孵育1h或2h的R^2分别为0.964 5和0.874 2;孵育温度为25℃的R^2=0.996 1。结论BSA封闭步骤对低浓度的样品检测灵敏度不强;样品和检测抗体及酶稀释液中必须含有吐温20且浓度在0.05%条件下最合适;样品和检测抗体共同孵育会影响对高浓度样品的检测;37℃和25℃的孵育温度条件下的酶联免疫吸附试验检测灵敏度没有差异,但25℃孵育可以降低OD值背景。

酶联免疫吸附(ELISA)法在食品微生物检测中的应用

介绍了酶联免疫吸附 (ELISA)分析的原理及方法 ,并就其在食品微生物检测中的应用作了较详细的描述。

猪肝和猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗残留的酶联免疫吸附检测法研究

采用混合酸酐法将沙丁胺醇与牛血清白蛋白偶联,并免疫家兔制备抗沙丁胺醇抗血清。以间接ELISA法测定血清效价,测得抗血清最佳工作浓度为1∶6400,该抗沙丁胺醇抗血清对克伦特罗有110%的交叉反应性。建立了能够同时检测SAL和CL的间接竞争ELISA方法,该方法对沙丁胺醇的检测范围为0148ng/mL～8.0μg/mL,对克伦特罗的检测范围为0143ng/mL～7.3μg/mL,对沙丁胺醇的检测灵敏度为0148ng/mL,对克伦特罗的检测灵敏度为0143ng/mL。在猪肝和猪尿中添加1～50ng/g(ng/mL)的沙丁胺醇,添加回收率为72.2%～8418%,变异系数为4.2%～28.3%,在猪肝脏和猪尿中添加1～50ng/g(ng/mL)的克伦特罗,添加回收率为8413%～103.4%,变异系数为013%～35.5%。