禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用AIV灭活油乳苗(H9N2)对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清,取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法,经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶(HRP),制备禽流感酶标抗体(IgG-HRP),利用所提取的AI-IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot-ELISA试验操作步骤,采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度,以及各步反应时间等最佳反应条件,以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot-ELISA检测法。结果表明,所制备的AI高免血清HI效价为10log2;AI酶标抗体克分子比值为2.45;优化的Dot-ELISA各条件为:包被AI-IgG最佳稀释倍数为1∶50;最佳封闭剂为1%牛血清白蛋白;AI酶标抗体最佳稀释倍数为1∶100;待检抗原与2种抗体的感作时间均为0.5h(37℃)。优化后的检测方法可在2.5h内诊断结果,制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍,与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5%福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌InternalinA(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7×105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。

双抗夹心ELISA检测食品中大肠杆菌O157:H7方法研究

研究获得纯化抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体,经检测10mg/ml纯化IgY抗体的效价为1:320;以大肠杆菌O157:H7免疫新西兰大耳白兔,获得兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体,效价达1:25600。以兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体稀释3200倍作为捕获抗体,抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7,正交试验分析表明,捕获抗体于37℃包被2h、不封闭、抗原与捕获抗体于37℃结合2h、检测抗体浓度为0.25mg/ml、与抗原于37℃结合1h为最优反应条件。该方法对纯培养菌液检出限为105CFU/ml,具有良好的敏感性及特异性。染菌样品经在EC增菌液中选择性培养后进行双抗夹心ELISA检测,接种量为0.1～1CFU/g(ml)的样品在培养12h后可检出阳性反应,1～10CFU/g(ml)的样品在培养8h后可检出阳性反应。

应用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍致病病原—创伤弧菌的研究

以皱纹盘鲍脓足病致病病原－ － 创伤弧菌为抗原，制备兔抗血清，抗体纯化后以辣根过氧化物酶标记，建立检测创伤弧菌的双抗夹心ＥＬＩＳＡ 检测法。结果表明，双抗夹心ＥＬＩＳＡ 法有较高的灵敏度，可检出含菌１０４ 个／ｍｌ 的菌悬液。与创伤弧菌对照菌株有明显的阳性反应不与副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、河流弧菌等８ 株对照菌株产生影响检测结果的交叉反应。应用该法检测３０ 份病鲍样品，阳性检出率为６６ ．７ ％ 。

检测BDV抗原的双抗夹心ELISA法的建立

目的建立检测博尔纳病病毒(BDV)抗原的双抗体夹心ELISA法,为简单、快速的临床应用奠定基础。方法根据双抗夹心ELISA法基本步骤,分别对BDV p24小鼠单克隆抗体、BDV p24兔多克隆抗体和酶标抗体作多梯度稀释,以确定最佳实验条件,并对其精密度、灵敏度、稳定性、准确性进行初步评价,同期收集病毒性脑炎(VE)患者脑脊液(CSF)44例和神经系统非炎性疾病患者CSF 44例,通过建立的双抗夹心ELISA法检测临床样本中是否存在BDV抗原。结果 BDV p24小鼠单克隆抗体的最佳稀释度为1∶160,BDV p24兔多克隆抗体的最佳稀释度为1∶2 500,酶标抗体的最佳稀释度为1∶5 000,该法的检测灵敏度为170 ng/ml,精密度批内变异<10%,批间变异<15%,同时具有良好的稳定性与准确性。另外用该法检测临床标本其中实验组有3例患者检出BDV抗原阳性,阴性对照组均未检出阳性病例。结论成功建立检测BDV抗原的双抗体夹心ELISA法。

双抗夹心ELISA法检测血浆HSP70的建立及初步应用

[目的]建立双抗体夹心法检测血浆中热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)水平。[方法]制备兔抗HSP70抗体 ,建立双抗体夹心法标准曲线 ,鉴定其最小检出限、精确度、回收率 ,并初步应用于检测40例男性健康成人血浆样本的HSP70水平。[结果]双抗夹心ELISA法检测HSP70的最小检出限为10ng/ml,标准曲线在10～100ng/ml范围内线性良好。3份同批血清标本分别重复8次测定 ,平均批内变异系数为7.6 % ;3份不同批血清分别重复6次测定 ,平均批间变异系数为12.7 %。血清中加入已知量的标准抗原 ,测得回收率为85.5 %。对40例男性健康成人(20.0±0.9)岁血浆样本检测 ,其HSP70浓度均值为 (151.0±13.8)ng/ml。[结论]本方法检测HSP70的可测范围广 ,灵敏度和精密度较高变异系数较小 ,表明其灵敏、特异。

双抗夹心ELISA法定量检测食品中大肠杆菌O157:H7初探

以鸡抗O157:H7特异性脂多糖(LPS)抗体(IgY)为捕获抗体,酶标抗体(HRP-IgY)为检测抗体建立双抗夹心ELISA法检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法,确定了抗原浓度对数与OD450值的高度线性相关性,根据检测OD450值可从拟合回归曲线确定样品中的含菌量,含菌量≥104CFU/ml的食品样品可直接用双抗夹心法进行检测,含菌量≤104CFU/ml的食品样品可增菌14h后检测。

黄瓜绿斑驳花叶病毒的双抗夹心ELISA检测

为建立快速、灵敏、准确且易操作的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)检测方法以实现早期诊断与控制病害,制备了8株效价大于1×10^(-7)的单克隆抗体,配对筛选结果表明经辣根过氧化物酶标记的A8H与单抗A3配对检测的灵敏度最高,并据此创制了双抗夹心ELISA试剂盒。该试剂盒对CGMMV具有特异反应,灵敏度达1∶12 800(g∶ml),准确度与RT-PCR结果吻合,检测周期小于5 h,可用于生产上病害发生初期的快速诊断与鉴定。

检测乳粉中克罗诺杆菌属穆汀斯克罗诺杆菌的双抗夹心ELISA方法的研究

获得了抗穆汀斯克罗诺杆菌的多克隆抗体,抗体只对穆汀斯克罗诺杆菌菌株有特异性识别,而对非穆汀斯克罗诺杆菌无交叉反应。利用所得到的抗体,建立了一种双抗夹心ELISA检测方法,该方法对纯培养穆汀斯克罗诺杆菌菌液检出限为105cfu/mL;经过17h增菌,全脂乳粉染菌样品中的穆汀斯克罗诺杆菌的检出限为0.1cfu/g。该方法为快速检测乳粉中穆汀斯克罗诺杆菌的污染奠定了基础。

双抗夹心ELISA检测兔出血症病毒抗原方法的建立及初步评估

为建立一种快速、特异性强的用于检测兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)抗原的双抗夹心ELISA方法,本研究通过抗体配对实验,确定以抗兔出血症病毒结构蛋白VP60单克隆抗体9H9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的9H9为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。通过优化,确定最佳条件为:0.5μg/m L稀释后的9H9作为捕获抗体,底物显色液37℃包被2 h 4℃过夜,1%明胶溶液37℃封闭2 h,用含10%胎牛血清的PBST按5μg/m L稀释后的辣根过氧化物酶标记的9H9作为检测抗体,37℃作用15 min。建立的ELISA方法与杯状病毒科其他病毒无交叉反应,应用本方法和RT-PCR方法对85份兔肝脏样品进行检测,证明双抗夹心ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,有望作为临床快速检测的一种简便方法。

卵转铁蛋白双抗夹心ELISA方法的建立

卵转铁蛋白是鸡蛋中的主要过敏原,针对鸡蛋中主要过敏原卵转铁蛋白建立了双抗夹心ELISA方法,该方法检出限为(15.37±1.20)ng/m L。除白蛋白外,该方法对粘蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶总蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生总蛋白、大豆、杏仁和绿豆等致敏蛋白几乎没有交叉反应。板内重复性和板间重复性较好,因此所建立的方法可用于对卵转铁蛋白的检测。

乳品中热带假丝酵母菌的双抗夹心ELISA快速检测方法

本研究用于乳品中热带假丝酵母菌的快速检测。采用热带假丝酵母菌超声破碎后的上清蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大耳白兔和Hartley豚鼠,获得热带假丝酵母菌的多克隆抗体。以兔抗体作为捕获抗体,豚鼠抗体作为检测抗体,通过矩阵法及正交分析建立乳品中热带假丝酵母菌快速、特异的双抗夹心ELISA检测方法。该方法检出限为98 ng/m L,板内变异系数小于2%,板间变异系数小于6%,特异性及重复性良好。实际样品检测中,通过对乳制品进行滤膜集菌并选择性增菌培养,超声后提取的蛋白上清应用本研究建立的双抗夹心ELISA检测方法,100 CFU/m L热带假丝酵母菌可在22 h内准确检测出阳性反应。

双抗夹心ELISA法检测双歧杆菌反应条件的优化

研究利用双抗夹心酶联免疫吸附法(Double-antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,Double-antibody Sand-wich ELISA)快速检测双歧杆菌(Bifidobacterium)的最佳反应条件。使用实验室自制的兔抗两歧双歧杆菌免疫血清和鼠抗两歧双歧杆菌免疫血清,利用方阵法对两种血清抗体的反应浓度进行筛选,之后对包被液、封闭液、封闭时间及底物作用时间进行比较和选择,从而确定运用双夹心ELISA法快速检测双歧杆菌的最佳反应条件。最佳反应条件分别为:兔抗两歧双歧杆菌免疫血清和鼠抗两歧双歧杆菌免疫血清反应浓度分别为1︰1280,1︰320,包被液浓度0.05 mol/L(pH值为9.6)的Na2CO3-NaHCO3,封闭液为质量分数为5%的BSA-PBS,封闭30min,底物作用时间为30 min。优化了双抗夹心ELISA法检测双歧杆菌的反应条件,为双歧杆菌的血清学检测提供了参考。

抗腺病毒五邻体单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

为获得稳定性好、特异性强、效价高的抗腺病毒五邻体单克隆抗体,用腺病毒五邻体基因工程表达抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,以腺病毒五邻体为筛选抗原对融合后的杂交瘤细胞间接ELISA进行筛选.结果表明:试验获得5株杂交瘤细胞,标记为3C4、4C4、4D7、4F2和4H3,4D7免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余4株为IgG1;对5株细胞连续3个月体外传代试验和小鼠腹水连续传代试验,5株细胞都能持续稳定分泌单克隆抗体,对细胞上清和腹水采用间接ELISA进行效价测定,细胞上清效价稳定维持在2 000左右,腹水效价稳定维持在200 000以上,且与引起腹泻的鼠伤寒沙门氏菌和轮状病毒无交叉反应;对其中可以配对的2株单抗4D7、4F2建立双抗夹心ELISA,可以应用于临床检测腺病毒.

ELISA双抗夹心法检测鸡IBV的研究

用差速离心结合不连续蔗糖密度梯度纯化的鸡传染性支气管炎病毒抗原免疫兔和鸡,获得高效价的多克隆免疫血情。经鸡胚胚体乳剂吸收和过DEAE-52纤维素柱提纯其IgG,建立了检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的ELISA双抗体夹心法。应用本ELISA对人工感染鸡和传染性支气管炎病鸡群的气管样本的检测,其病毒抗原阳性检出率分别为10O％(20/20)和78％(39/50)。实验结果表明,ELISA双抗体夹心法对鸡传染性支气管炎的早期诊断具有简单、快速、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本试验以牛乳铁蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了3株稳定分泌乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、3F8和4D3,最后用相对亲和力最强的3C6所产生的抗体作为包被抗体,用辣根过氧化物酶标记过的多克隆抗体作为酶标抗体,最终建立了用于检测牛乳汁中乳铁蛋白含量的双抗夹心ELISA检测方法,该法对牛乳铁蛋白最低检测限为4 ng/m L,最适检测范围为4~256 ng/m L。

双抗夹心ELISA检测小鹅瘟病毒的研究

采用双抗夹心ELISA方法快速检测样品中的小鹅瘟病毒。结果表明,该方法特异性较好,灵敏度可达0.7412μg/mL。该方法可以用于鹅细小病毒(GPV)的临床诊断及样品中有效抗原组分的检测,结果准确、快速、重复性好,且EL1SA效价与AGP效价具有相关性。

双抗夹心酶联免疫(ELISA)方法测定卵类黏蛋白

卵类黏蛋白是鸡蛋中的主要过敏原,因此建立相应的检测方法对保障消费者健康非常重要。为此本试验分别制备了卵类黏蛋白特异性兔多克隆抗体和鼠多克隆抗体,对不同检测条件进行优化,最终建立了一种用于定量分析卵类黏蛋白的双抗夹心ELISA方法,并对检测方法的精密度进行考察。结果表明,通过对封闭液、捕获抗体包被量和检测p H的优化,该方法的最低检出限达到(0.274±1.27)ng/m L,且具有良好的特异性以及检测精密度。因此,所建立的方法可用于食品中卵类黏蛋白的定量检测。

双抗夹心ELISA方法检测转cry8Ca基因烟草的杀虫蛋白

为了检测抗金龟子幼虫的转cry8Ca基因烟草杀虫蛋白的含量，对双抗夹心酶联免疫吸附法（DAS—ELISA）检测体系中的反应条件进行了优化。采用方阵法对血清抗体的反应浓度进行筛选，对提取液、包被液、封闭液和底物作用时间进行比较和优选，结果确定多克隆抗体浓度为1：3200，酶标结合物浓度为1：400，pH9．6碳酸缓冲液提取，pH7．4磷酸缓冲液包被，0．5％明胶．PBST封闭，TMB底物作用15min为最佳双抗夹心ELISA检测条件。通过这一检测体系，对转cry8Ca基因烟草植株进行检测，S12株系的Cry8C蛋白含量最高，每克鲜重含有12．683～14．461μg，占总蛋白量的0．052％-0．062％。

双抗夹心ELISA法检测弓形虫核苷三磷酸脱氢酶-Ⅱ型蛋白的研究

目的建立双抗夹心ELISA法检测弓形虫核苷三磷酸脱氢酶-Ⅱ型(NTPase-Ⅱ)蛋白。方法用重组弓形虫NTPase-Ⅱ(rTgNTPase-Ⅱ)蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高滴度、高特异性的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA法。通过检测弓形虫速殖子全虫蛋白与rTgNTPase-Ⅱ的浓度评价该方法的敏感性。通过对疟疾(7例)、日本血吸虫病(12例)、并殖吸虫病(14例)和脑囊尾蚴病(10例)患者血清进行交叉反应试验,评价该方法的特异性。结果获得2株稳定分泌抗rTgNTPase-Ⅱ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为MNT1和MNT2。蛋白质印迹分析(Westernblotting)显示,2株单克隆抗体均能特异性识别弓形虫rTgNTPase-Ⅱ蛋白和弓形虫速殖子全虫蛋白。以MNT1为包被抗体,MNT2为酶标抗体,建立的双抗夹心ELISA可检测出全虫蛋白的最低浓度为6μg/ml,检测出rTgNTPase-Ⅱ的最低浓度为1.5μg/ml。该方法的特异性为100%。结论以抗rTgNTPase-Ⅱ蛋白单克隆抗体MNT1与MNT2为基础建立的双抗夹心ELISA法具有较高的特异性。