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双基础、双报告模式下行政事业单位会计计量差异及管理模式探究
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作者 葛继远 《中国农业会计》 2023年第1期26-29,共4页
《政府会计制度——行政事业单位会计科目和会计报表》2019年正式实施,标志着财务会计与预算会计同步应用到行政事业单位,也由此产生了财务会计与预算会计计量差异,本文将全面分析双重计量模式下差异表现以及财务管理方面的应对措施.
关键词 基础 双报告 差异
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含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析 被引量:2
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作者 管洁 王秀平 +3 位作者 邓瑶 周为民 吴小兵 谭文杰 《生物技术通讯》 CAS 2011年第2期199-202,共4页
目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质... 目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR'Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。 展开更多
关键词 分泌型萤光素酶 双报告基因 慢病毒载体
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利用果蝇细胞研究基因表达转录后调控的双报告基因系统的建立
3
作者 张婷 肖强海 +2 位作者 韦有恒 刘勇 马维骏 《现代检验医学杂志》 CAS 2010年第4期22-24,27,共4页
目的 构建能够在果蝇S2*细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海... 目的 构建能够在果蝇S2*细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海洋腔肠荧光素酶的质粒pAc-Rluc.将TNF-α基因mRNA的3'UTR连接至pAc-Fluc的Luc编码区下游构建pAc-Fluc-TNF-α质粒,并与pAc-Rluc共转至果蝇S2*细胞,检测两种荧光素酶的相对活性.结果 成功构建了能够在果蝇S2*细胞中组成型表达的双报告基因系统;在TNF-α mRNA 3'UTR控制下表达的荧光素酶活性比对照有显著下降.结论 可以利用该双报告基因系统在果蝇细胞中研究转录后调控元件对基因的表达调控. 展开更多
关键词 转录后调控元件 双报告基因 荧光素酶 果蝇S2*细胞
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高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用
4
作者 叶玲玲 李世崇 +3 位作者 孙海燕 蓝三春 陈昭烈 王启伟 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2017年第12期1903-1908,共6页
背景:胰岛细胞移植是治疗1型糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。多能干细胞有望成为胰岛细胞移植的理想种子细胞,但其向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。目的:构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体,探讨其... 背景:胰岛细胞移植是治疗1型糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。多能干细胞有望成为胰岛细胞移植的理想种子细胞,但其向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。目的:构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体,探讨其实时监测诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化中关键性基因表达的可行性。方法:首先在pT iger载体上引入嘌呤霉素抗性,然后以646 bp的小鼠Ins1启动子替换了原来载体上410 bp的小鼠Ins1启动子,获得高效Pdx1/insulin双报告基因载体。最后,将载体导入INS-1细胞和诱导多能干细胞,验证其功能。结果与结论:(1)实验成功构建了高效Pdx1/insulin双报告基因载体;(2)在INS-1细胞中验证了载体获得嘌呤霉素抗性,提高了insulin表达效率,并在INS-1细胞中检测到Pdx1和insulin的表达;(3)实验初步证明了Pdx1/insulin双报告基因能够有效监测细胞分化过程中Pdx1和insulin基因的表达。 展开更多
关键词 组织构建 组织工程 诱导多能干细胞 Pdx1 双报告基因 胰岛Β细胞 诱导分化 国家自然科学基金
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利用高压水枪法将双报告基因导入小鼠肝脏
5
作者 贾俊双 林霞 +4 位作者 罗冰敏 陈丽 刘宇 肖东 林晓琳 《临床医学进展》 2016年第3期122-127,共6页
目的:通过高压水枪法将双报告基因[即绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)]导入小鼠肝脏,以熟练掌握高压水枪法,其将为后续相关研究奠定方法学基础。方法:将质粒pcEF.luc-IRES-GFP瞬时转染入人肝癌细胞SMMC-7721以进行载体体外功能... 目的:通过高压水枪法将双报告基因[即绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)]导入小鼠肝脏,以熟练掌握高压水枪法,其将为后续相关研究奠定方法学基础。方法:将质粒pcEF.luc-IRES-GFP瞬时转染入人肝癌细胞SMMC-7721以进行载体体外功能验证,并利用高压水枪法将质粒pcEF.luc-IRES-GFP经尾静脉注射入小鼠肝脏内,经小动物活体成像系统活体检测GFP和Luc信号,同时免疫组化检测GFP在肝组织中的表达情况。结果:瞬转结果显示,7721细胞上可检测到GFP和Luc表达;利用高压水枪法将pcEF.luc-IRES-GFP导入小鼠肝脏后,利用小动物活体成像仪成功在肝内检测到GFP和Luc信号;免疫组化结果显示部分肝细胞表达GFP。结论:成功掌握了将目的基因导入小鼠肝脏的高压水枪法,这为相关后续研究打下良好基础。 展开更多
关键词 高压水枪法 尾静脉 肝脏 双报告基因
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基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控
6
作者 王志远 刘月环 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第11期78-84,共7页
目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-... 目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。 展开更多
关键词 非酒精性脂肪性肝病模型 长爪沙鼠 Cip4基因 荧光素酶双报告基因系统 维甲酸X受体(RXR) 甲状腺素受体B(TRB)
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基于“双功能、双基础、双报告”的政府会计系统核算体系研究 被引量:10
7
作者 邱均成 何涛 高丽萍 《教育财会研究》 2019年第1期37-42,共6页
政府会计制度的颁布对高校财务信息化提出了新的要求,构建基于"双功能、双基础、双报告"的政府会计信息系统成为顺利实现转轨改制的基础和关键。本文运用归纳、演绎、比较等分析方法,分析了政府会计核算对高校会计信息系统功... 政府会计制度的颁布对高校财务信息化提出了新的要求,构建基于"双功能、双基础、双报告"的政府会计信息系统成为顺利实现转轨改制的基础和关键。本文运用归纳、演绎、比较等分析方法,分析了政府会计核算对高校会计信息系统功能的新要求,对高校构建"双功能、双基础、双报告"政府会计信息系统进行了总体规划,提出了建立多维度政府会计核算体系的设计思路,并对运用智能引擎自动"平行记账"的内在原理及设计实现进行了研究。 展开更多
关键词 功能 基础 双报告 政府会计 信息系统
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基于“双功能、双基础、双报告”的政府会计信息系统核算体系研究 被引量:12
8
作者 邱均成 何涛 高丽萍 《商业会计》 2019年第6期8-11,共4页
政府会计制度的颁布对高校财务信息化提出了新的要求,构建基于"双功能、双基础、双报告"的政府会计信息系统成为顺利实现转轨改制的基础和关键。文章运用归纳、演绎、比较等方法,分析了政府会计核算对高校会计信息系统功能的... 政府会计制度的颁布对高校财务信息化提出了新的要求,构建基于"双功能、双基础、双报告"的政府会计信息系统成为顺利实现转轨改制的基础和关键。文章运用归纳、演绎、比较等方法,分析了政府会计核算对高校会计信息系统功能的新要求,对高校构建"双功能、双基础、双报告"政府会计信息系统进行了总体规划,提出了建立多维度政府会计核算体系的设计思路,并对运用智能引擎自动"平行记账"的内在原理及设计实现进行了研究。 展开更多
关键词 功能 基础 双报告 政府会计 信息系统
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党员干部下沉社区长效机制研究——以湖北省荆门市开展的“双报到、双报告”活动为例 被引量:1
9
作者 温媛媛 《三晋基层治理》 2021年第1期67-71,共5页
湖北省荆门市开展的“双报到、双报告”活动,为党员干部参与社区治理提供了新的路径。目前,湖北省荆门市开展“双报到、双报告”活动,面临着顶层设计有待进一步完善、组织保障有待进一步落实、考核制度有待进一步健全等问题。为此,应加... 湖北省荆门市开展的“双报到、双报告”活动,为党员干部参与社区治理提供了新的路径。目前,湖北省荆门市开展“双报到、双报告”活动,面临着顶层设计有待进一步完善、组织保障有待进一步落实、考核制度有待进一步健全等问题。为此,应加强顶层设计,健全下沉社区组织体系;加强组织保障,调动党员干部下沉积极性;加强制度建设,推进党员干部下沉规范化管理;建立定岗机制,实现下沉服务精准对接;注重居民自治,提升群众参与社区治理的内生动力;凝聚社会资源,搭建社区治理联动机制;创新服务模式,提升下沉社区活动实效性。通过以上措施,营造共建共治共享的社会治理格局。 展开更多
关键词 党员干部 下沉活动 社区治理 报到、双报告”活动
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对政府会计制度双基础与双报告的理解刍议 被引量:6
10
作者 周珂 《财会学习》 2020年第8期164-165,共2页
政府会计制度的改革,对实施政府会计制度的单位提出了更高的要求,单位该如何对政府会计制度的“双基础”“双报告”进行正确的理解是单位亟待解决的问题,以及单位如何正确的将“双基础”“双报告”这一概念实施下去都需要进行初阶段的... 政府会计制度的改革,对实施政府会计制度的单位提出了更高的要求,单位该如何对政府会计制度的“双基础”“双报告”进行正确的理解是单位亟待解决的问题,以及单位如何正确的将“双基础”“双报告”这一概念实施下去都需要进行初阶段的策划和摸索。从国家对于政府会计制度的改革中可见,政府的会计信息系统是否能够顺应时代转化成符合新时代发展的会计信息系统,其关键点就是基于“双基础、双报告”这两个新的概念。这两个概念对政府会计制度进行了总体上的规划,从对会计核算体系的建立思路来看也是朝着多维度的方向进行的。 展开更多
关键词 基础 双报告 政府会计
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“双体系、双基础、双报告”模式下政府会计制度应用 被引量:1
11
作者 王蓓 《经济管理文摘》 2020年第11期146-147,共2页
目前,于我国社会主义制度经济发展之中,经济体系进行不断革新,这使得政府会计制度也随之革新,并提出了更加科学的要求,而“双体系、双基础、双报告”模式的提出,对各个单位实施政府会计制度要求做出了方向性指导,同时,实施的过程也是不... 目前,于我国社会主义制度经济发展之中,经济体系进行不断革新,这使得政府会计制度也随之革新,并提出了更加科学的要求,而“双体系、双基础、双报告”模式的提出,对各个单位实施政府会计制度要求做出了方向性指导,同时,实施的过程也是不断积累经验摸索的过程。政府会计制度的革新要跟随时代发展的脚步,顺应现代化信息社会发展的要求,“双体系、双基础、双报告”模式需各单位从多角度、多层面去理解其中内涵,才能更好的执行并应用此模式。 展开更多
关键词 体系 基础 双报告 政府会计制度
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“双功能、双基础、双报告”核算模式对事业单位会计核算的影响与对策研究 被引量:1
12
作者 吕永枝 《当代会计》 2022年第24期128-130,共3页
新《政府会计制度》对政府会计核算提出了更高的要求,要求事业单位会计核算遵循“双功能、双基础、双报告”核算模式。文章阐述了“双功能、双基础、双报告”核算模式对事业单位会计核算的影响,探究了“双功能、双基础、双报告”核算模... 新《政府会计制度》对政府会计核算提出了更高的要求,要求事业单位会计核算遵循“双功能、双基础、双报告”核算模式。文章阐述了“双功能、双基础、双报告”核算模式对事业单位会计核算的影响,探究了“双功能、双基础、双报告”核算模式下事业单位会计核算如何实现提质增效,即在资产核算上,事业单位应当完善资产清查方式、搭建有利平台、加强对财务会计人员的培养;在收支核算上,事业单位应当注重收支核算科目的设置和使用、提高预算执行的“刚性”、完善预算监督体系。 展开更多
关键词 《政府会计制度》 功能” 基础” 双报告 事业单位
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以“双报到、双报告”制度助推社区共建共治共享——湖北城市社区实现共建共治共享的路径及策略
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作者 邓洪洁 《中国管理信息化》 2022年第21期192-195,共4页
城市社区治理中“参与不足”是一个普遍问题,尤其是社区中层人士与社区的弱联结使其缺少参与社区治理的途径。“双报到、双报告”制度的实施有利于挖掘社区内的资源,使更多中层人士通过政治安排的方式参与社区治理,有利于建立对社区的... 城市社区治理中“参与不足”是一个普遍问题,尤其是社区中层人士与社区的弱联结使其缺少参与社区治理的途径。“双报到、双报告”制度的实施有利于挖掘社区内的资源,使更多中层人士通过政治安排的方式参与社区治理,有利于建立对社区的利益联结、情感归属与文化认同。建立健全“双报到、双报告”制度要明确各行为主体的行动要求、完善相关机制保障以及优化制度实施的策略安排。 展开更多
关键词 报到 双报告 社区治理 路径选择
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CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用
14
作者 林海霞 舒丹桦 《现代实用医学》 2023年第11期1405-1408,共4页
目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因... 目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。 展开更多
关键词 CXCR4 3’-非编码区 荧光素酶报告载体 miR-494
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基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用
15
作者 杜雅婷 于文君 +2 位作者 李燕 付元磊 孙考祥 《山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报》 CAS 2023年第3期180-185,共6页
目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组... 目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。 展开更多
关键词 Golden Gate CcdB基因 荧光素酶报告基因 分子克隆 RNAi药物筛选
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双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展 被引量:14
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作者 耿德玉 原媛 郭华荣 《科技资讯》 2012年第21期1-1,共1页
双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用... 双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。 展开更多
关键词 双报告基因 萤火虫荧光素酶 海肾荧光素酶
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EGFP-LacZ双报告基因真核表达载体的构建及体外表达 被引量:1
17
作者 刘莉 周政 +3 位作者 采克俊 张易祥 何湃 曹访 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期65-69,共5页
构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定... 构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定后,在脂质体介导下转染293FT细胞株及鸡胚成纤维细胞,通过荧光观察和组织化学方法检测Egfp和LacZ基因的表达。结果表明,LacZ基因被克隆到pEGFP-C1,成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光,组织化学方法检测到呈蓝色的细胞,表明两个报告基因均能在细胞内正确表达。 展开更多
关键词 β-半乳糖苷酶绿荧光蛋白 双报告基因 真核表达
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双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及鉴定 被引量:1
18
作者 崔力沙 崔博沛 +4 位作者 陈磊 吴星 梁争论 徐艳玲 李克雷 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第7期738-742,747,共6页
目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为筛选携带报告基因的肿瘤细胞系提供分子工具。方法以质粒pcDNA3.1、pcDNA6-GFP、pSVA-Luc为模板,分别扩增CMV、GFP和Luc基因序列,通过In-fusion法将3个基因片段与经HindⅢ... 目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为筛选携带报告基因的肿瘤细胞系提供分子工具。方法以质粒pcDNA3.1、pcDNA6-GFP、pSVA-Luc为模板,分别扩增CMV、GFP和Luc基因序列,通过In-fusion法将3个基因片段与经HindⅢ、XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1载体连接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,荧光显微镜直接观察GFP的表达,化学发光仪检测Luc的表达。提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增p53基因,通过In-fusion法将p53基因连接于质粒pC-T2A-Luc-GFP上,构建质粒pC-p53-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,Western blot法检测p53的表达,化学发光仪检测Luc的表达。结果重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP经酶切及测序鉴定构建正确,GFP和Luc双报告基因均可在293T细胞中正确表达,且可用于后续的动物模型建立。pC-p53-T2A-Luc-GFP质粒中p53的插入降低了Luc的表达,但其表达仍为阳性,不影响Luc的正常检测。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,并可在293T细胞中表达,为建立携带报告基因的肿瘤细胞系及肿瘤模型奠定了分子基础。 展开更多
关键词 启动子 双报告基因 绿色荧光蛋白 荧光素酶
原文传递
采用双荧光素酶报告法验证乳腺癌中miR-155靶标 被引量:4
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作者 孟丽 纪婷 +5 位作者 李鹿丰 张喜平 杨红健 朱聪 郭江峰 丁先锋 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期189-195,共7页
MiR-155与乳腺癌发生发展密切相关.本研究以乳腺癌组织和血清中均显著高表达的miR-155为研究对象,利用TargetScan和PicTar预测miR-155的靶基因.根据miR-155与靶基因结合的保守性、动力学及靶基因功能,筛选出miR-155的靶基因ACTA1(actin ... MiR-155与乳腺癌发生发展密切相关.本研究以乳腺癌组织和血清中均显著高表达的miR-155为研究对象,利用TargetScan和PicTar预测miR-155的靶基因.根据miR-155与靶基因结合的保守性、动力学及靶基因功能,筛选出miR-155的靶基因ACTA1(actin alpha 1,skeletal muscle)和CEBPB(CCAAT/enhancer binding protein beta),并用双荧光素酶报告法验证.将ACTA1和CEBPB的3'-UTR(3'-untranslated region)全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,并构建结合位点的突变序列,得到pRL-TK-Aw、pRL-TK-Am、pRL-TK-Cw、pRL-TK-Cm载体.不同海肾荧光素酶载体转染Bcap37乳腺癌细胞,同时转染miR-155及内参对照萤火虫荧光素酶载体pGL3-control.根据不同转染的海肾荧光素酶表达活性,运用SPSS软件分析,结果显示,CEBPB是miR-155在乳腺癌中的直接靶基因(P<0.05).miR-155通过下调CEBPB影响乳腺癌的发生. 展开更多
关键词 MIR-155 靶基因 荧光素酶报告 CEBPB
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应用RGS双荧光替代性报告载体提高CRISPR/Cas9对猪BMP15基因的打靶效率 被引量:4
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作者 王敏 石翾 +5 位作者 黄翔 刘小凤 覃玉凤 刘小红 陈瑶生 何祖勇 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期48-55,共8页
我国是家猪养殖和消费大国,提高母猪的繁殖力对于促进我国生猪产业的发展具有重要的作用。排卵率和产仔数是影响家畜繁殖力的关键因素,其中BMP15(bone morphogenetic protein 15)基因已被鉴定是控制绵羊排卵数和多胎性状的一个主效基因... 我国是家猪养殖和消费大国,提高母猪的繁殖力对于促进我国生猪产业的发展具有重要的作用。排卵率和产仔数是影响家畜繁殖力的关键因素,其中BMP15(bone morphogenetic protein 15)基因已被鉴定是控制绵羊排卵数和多胎性状的一个主效基因,然而目前在家猪BMP15基因中尚未发现类似绵羊多胎品系的天然突变。基于高等哺乳动物基因功能的保守性和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)等基因组编辑技术对动物基因组定点修饰的高效性,应用CRISPR/Cas9技术对家猪BMP15基因进行精确的遗传修饰,使家猪获得类似多胎绵羊的天然突变,对于研究该基因对家猪繁殖力的影响以及培育高繁殖力家猪新品系具有重要的意义。本研究通过CRISPR/Cas9对长白猪胎儿成纤维(porcine embryonic fibroblasts,PEF)细胞中BMP15基因进行打靶,T7E1分析显示打靶效率仅有5%。随后通过共转染RGS双荧光替代性报告载体(RFP-GFP surrogate reporter),并应用流式细胞术分选出双荧光细胞,富集到基因组被CRISPR/Cas9修饰的细胞,使基因打靶效率提高至18%。本研究结果表明,应用RGS双荧光替代性报告载体可以有效提高CRISPR/Cas9在PEF细胞中对BMP15基因的打靶效率,为今后通过体细胞核移植技术培育BMP15基因编辑猪进行了有效的探索。 展开更多
关键词 BMP15基因 CRISPR/Cas9 RGS荧光替代性报告载体
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