基于双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术的核酸杂交试纸条快速检测驴肉中的马源性成分

目的建立快速、操作简单、价格相对低廉的重组聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术结合核酸杂交试纸条快速检测驴肉中马源性成分的可视化检测技术。方法将双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术与核酸杂交试纸条相结合。针对马线粒体细胞色素b(cytb)基因设计拖尾RPA引物,这对特殊引物使RPA扩增子带有两个单链拖尾序列,这两个单链拖尾序列可以特异性地被金纳米探针和试纸条上的检测探针识别并捕获,形成一条肉眼可见的红色条带,从而对马源性成分进行检测。结果该方法整个扩增(15 min)和检测(5 min)过程在20 min即可完成,对马肉的检出限达到0.010%,且仅对马肉核酸有特异性扩增,与其他8个物种的核酸均无交叉反应。20份市售驴肉样品中有2份存在马源性成分,且该方法与PCR结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论该方法特异性强、灵敏度高,可实现驴肉中马源性成分的可视化快速检测。

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的 建立双拖尾重组聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合核酸杂交侧流条(nucleic acid hybridization-lateral flow strip, NAH-LFS)快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法 采用多重双拖尾RPA技术与NAH-LFS相结合,对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝3种颜色的金纳米探针和侧流条上的检测探针杂交。结果 鸡、鸭、猪3个物种RPA产物与探针杂交后形成肉眼可见的红、黄、蓝3色条带,整个RPA扩增(15 min)和侧流条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检出限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分, 10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分, 10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与聚合酶链式反应结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论 RPA技术结合NAH-LFS具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。