双控表达载体系统的构建及其在基因表达方面的应用（英文）

可严格调控性是体现原核表达载体优越性的重要指标。构建了一种双控双调节原核表达载体系统,用双载体控制调节目的基因的表达,即SP6启动子(promoter)+乳糖(lac)调节基因表达系统和araB启动子(promoter)+ara C调节基因表达系统,分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖(L-arabinose)诱导目的基因的表达。该系统由2个表达载体共同完成目的基因的表达。pE SP-1为主表达载体,即目的基因克隆到此表达载体上,由SP6启动子(promoter)+乳糖(lac)调节基因调控;pA RA-SP6为辅助表达载体,该载体通过SP6 RNA聚合酶的表达来控制调节主表达载体的启动子(SP6),由araB启动子(promoter)+ara C调节基因调控。实验结果显示该双控双调节表达载体系统控制严格,并且表达蛋白的量具有可调控性。

受强力霉素调节的自杀基因表达载体系统的构建和在乳腺癌细胞株(MCF-7)的表达

自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一 .以逆转录病毒载体———pRevTRE为基础进行载体构建 ,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSVtk)进行扩增 ,将HSVtk基因插入到pRe vTRE ,形成重组载体pRevTRE/HSVtk ,用磷酸钙共沉淀法 ,经过两轮转染 ,分别将pRevTRE/HSVtk和pRevTet On质粒导入乳腺癌细胞株 (MCF 7) .经过潮霉素B(HygromycinB)和G418筛选 ,建立了一株稳定的受四环素衍生物———强力霉素 (Doxycycline ,Dox)调控、表达HSVtk基因产物的人乳腺癌细胞株MCF/TRE/tk/Tet On .HSVtk基因表达产物可以将无毒性的药物前体Ganciclovir (GCV)转变成一种有毒的代谢产物 ,从而杀死乳腺癌细胞株(MCF 7) ,达到基因治疗的目的 .

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子 Ptrc和加强型绿色荧光蛋白 ( EGFP)基因从 EGFP原核表达质粒 p YA3 3 3 4-EGFP上切下 ,然后将其插入至真核表达质粒 p VAX1真核启动子 Pcmv的下游 ,构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒 p VAXD-EGFP,其长度为 3 82 3 bp。将 p VAXD-EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0和转染 COS-7细胞 ,应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS-PAGE测定 EGFP原核表达 ;应用荧光显微镜观察 EGFP在 COS-7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0 ( p VAXD-EGFP)表达 EGFP的量与仅以原核方式表达 EGFP的 X45 5 0 ( p YA3 3 3 4-EGFP)相当 ;将质粒p VAXD-EGFP转染 COS-7细胞 ,EGFP可在 COS-7细胞核和胞浆表达 ,在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明 :不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒 p VAXD-EGFP,而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平 。

食品级高效诱导表达系统—NICE系统

乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因表达的,含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的,其应用前景十分广阔。

无选择标记的高光效基因植物表达载体的构建

构建无选择标记的玉米高光效基因植物表达载体,旨在利用共转化系统获得无标记基因的高光效转基因植物.

不同剂量双表达蛋白VP2-IL-18免疫原性的比较

【目的】基于IL-18具有双向免疫调节作用,摸索利用Bac-to-Bac系统双表达的蛋白VP2-IL-18的最佳免疫增强剂量。【方法】采用腿部肌肉多点注射方法将不同剂量VP2-IL-18免疫14日龄SPF鸡,14 d后加强免疫1次;一免后第0、7、14、21、28和35天采集外周血检测ELISA抗体效价和CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞的数量;一免后第35天用vvIBDV-GX8/99毒株进行攻毒。【结果】各剂量VP2-IL-18免疫雏鸡后均能提高抗体滴度,促进CD4^(+)T和CD8^(+)T淋巴细胞增殖以及提高攻毒保护率,且200μg VP2-IL-18免疫组效果最佳,要优于低剂量免疫组和高剂量免疫组,差异显著(P<0.05)。【结论】VP2-IL-18具有良好的免疫原性,且200μg为最佳免疫剂量,不呈现高剂量依赖。

短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰(英文)

背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAinterference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法:利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果:DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论:shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。

双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能

囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调节结构域(R)断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl-通道功能。将人CFTRcDNA于R结构域的Ser712密码子前断裂,构建一对融合SspDna Bintein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾(BHK)细胞,通过瞬时表达,全细胞和单通道膜片钳记录Cl-电流,并用Westernblotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明,共转染细胞显示较高的全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性,说明CFTR的Cl-通道功能的恢复,用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Westernblotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成,表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示,蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因,为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。

IL-28A在家蚕BmN细胞及蛹中的表达

IL-28A是2003年Sheppard等报道的白细胞介素，它属于干扰素λ（IFN-λ）类。IL-28主要功能有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等作用。Bac—to-Bae家蚕杆状病毒表达载体系统不仅表达水平高而且对人安全，蚕蛹可药、可食，利用家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白为基因工程口服药物的研发提供了可能。

寡聚蛋白Trim34α对NF-κB报告基因的负向调节作用

目的构建人Trim34α的真核表达载体，观察其对接头蛋白TAB2诱导的NF-κB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法以HeLa细胞eDNA为模板扩增Trim34α全长基因，克隆到5’-Flag-peDNA3．1（＋），并通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞，蛋白印迹检测Trim34α蛋白的表达特点，双荧光素酶报告基因系统检测Trim34α对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化的影响。结果经鉴定成功构建Trim34α真核表达载体，该载体表达的Trim34α蛋白能相互聚集形成寡聚体（Trim小体）；Trim34α可显著抑制TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活化。结论Trim34α可以在胞内形成寡聚体，Trim34α能显著抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因活化。