利用双标准曲线法检测刺萼龙葵SrDOG1基因的表达

双标准曲线法是基因表达定量研究中应用较广的一种相对定量检测方法。本研究结合绝对定量的原理,对传统双标准曲线法进行了改进。以刺萼龙葵延迟萌发基因DELAY OF GERMINATION 1(DOG1)的表达检测为例,选择β-actin为内参基因,分别将目的基因和内参基因片段插入pEASY-Blunt Zero载体,制作标准质粒。提取冷藏或常温储藏种子的RNA进行荧光扩增,同时将标准质粒梯度稀释液作为模板构建标准曲线,以此计算SrDOG1的相对表达量。结果表明,双标准曲线法能够灵敏地检测SrDOG1基因的差异表达,发现冷藏种子中SrDOG1基因的表达量较常温储藏显著增高。双标准曲线法检测结果稳定,重现性好,数据处理简单,适用于多种条件下基因表达水平的比较,为进一步系统研究刺萼龙葵DOG1基因的表达特性和基因功能奠定了基础。

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。

PRNP基因SYBR GreenⅠ双标准曲线法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立双标准曲线法荧光定量PCR检测方法,以PRNP为目标基因、β-actin为内参基因进行扩增,将扩增产物连入pMD18-T载体,获得阳性标准品进行定量扩增。并将MDV标准毒株MD5、疫苗株CV1988和1株野毒株接种CEF,收集不同日龄病变细胞以提取RNA,用以上方法进行扩增。把结果代入标准曲线公式进行计算,分析PRNP基因表达与MDV致瘤的相关性。结果显示,该方法能检测出的PRNP基因和β-actin基因的最低拷贝数为1×103,特异性和重复性较好。相对于对照组,接种3株毒株的PRNP的表达量都有明显的差异。表明MDV的感染对PRNP的表达量确实存在影响。据此推测PrPC对MDV的感染可能发挥着重要的生理功能。

TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法建立

目的以β2-微球蛋白(B2M)为内参基因,建立一种检测CHO细胞中外源基因H拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。方法使用含有目的基因H和内参基因B2M的质粒作为标准品,分别建立目的基因H和内参基因B2M的标准曲线。提取重组CHO细胞基因组DNA,并对所提基因组中目的基因H和内参基因B2M的拷贝数同时进行qPCR检测。结果成功建立了目的基因H和内参基因B2M的标准曲线,扩增效率分别为92.09%和94.96%。标准曲线的相关系数均在0.99以上,且具有良好的重复性。随着细胞传代的增加,目的基因的拷贝数相对稳定。结论成功建立了TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法,该方法可用于外源基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究。

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考。【方法】采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法。【结果】构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=-0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高。在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0。【结论】建立的转基因烟草中外源基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析。

鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选

采用双标准曲线相对实时荧光定量PCR法,分别以23℃常温对照组和6℃低温待测组的黑龙江鲤脑组织cDNA为模板,以18S rRNA为内参基因,检测26个候选基因的相对表达量。实验数据经显著性分析发现,有5个候选基因在低温条件下表达量显著上升(P<0.01),与对照组相比它们的表达量分别上升了2.11倍、13.9倍、2.52倍、7.38倍和1.83倍,基因功能比对结果表明其编码蛋白产物分别是脂肪酸链延伸蛋白、酰基辅酶A脱氢酶、转录起始因子IIB、肌醇-1-磷酸合成酶、血脑屏障HT7抗原;有7个候选基因在低温下表达量分别下降了21.8%、25.9%、16.6%、23.7%、15.8%、16.3%、42.5%,但对照组和待测组差异不显著(P>0.05),基因功能比对发现它们主要参与抑制糖酵解,促进细胞凋亡和干扰神经系统的重塑活动。上述低温下表达量显著上升的5个冷诱导候选基因的获得为今后进行不耐低温鱼类的基因工程育种提供了基因元件。

草菇冷诱导基因Cor4在低温下表达变化的研究

将草菇菌株V23和耐低温诱变草菇菌株VH3的菌丝体在4℃低温条件下处理不同时间后,分别提取总RNA,反转录获得cDNA作为待测模板,构建含Cor4基因和GPD内标基因片段的质粒作为标准品,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了Cor4基因在低温下的表达变化。结果表明:草菇V23菌株的Cor4基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6 h达到最低值,8 h和10 h该基因的表达量略有回升;而VH3菌株Cor4基因低温处理后表达量呈上升趋势,至4 h达最高值,6 h时略有下降,8 h达最低值,10 h又开始上升,8 h和10 h均低于0 h表达量。

草菇冷诱导基因Cor1在低温下表达变化的研究

将草菇菌株V23和耐低温诱变草菇菌株VH3的菌丝在4℃下处理不同时间,分别提取RNA,反转录获得cDNA作为模板,构建含Cor1基因和GPD内标基因片段的质粒作为标准品,采用荧光定量PCR技术研究Cor1基因在低温下的表达变化。结果表明草菇V23菌株的Cor1基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,8h开始该基因的表达量上升;而VH3菌株Cor1基因低温处理后表达量明显增加,2h达到最大值,4h下降,但6h开始上升,10h又下降。通过推测Cor1基因表达与草菇耐低温特性有相关性,为今后利用草菇自身的抗寒机制进行遗传改造提供理论依据。

茎环引物实时定量PCR技术用于检测异核苷修饰的siRNA的可行性研究

本文考察了茎环引物实时定量PCR技术用于定量检测D-/L-异核苷(D-/L-iso NA)修饰的siRNA的可行性.根据阈值循环数(Ct值)及异核苷修饰的siRNA模板的初始浓度的对数值(lgC)绘制了标准曲线,与siRNA的标准曲线进行对比,发现D-异尿苷(D-isodU)修饰的siRNA(D-isodU-siRNA)不影响茎环引物实时定量PCR过程,而L-isodU修饰的siRNA(L-isodU-siRNA)降低了逆转录效率,而使测得的Ct值偏高,且对逆转录效率的影响有浓度依赖性和修饰位点特异性.因此,对前者既可进行绝对定量也可进行相对定量,对于后者只能进行绝对定量.将上述方法应用于isodU-siRNA血清稳定性的检测,获得了更可靠的定量结果.运用双标准曲线法,可进行胞内isodU-siRNA的定量检测.