流式细胞术检测中性粒细胞产生活性氧方法学探讨

目的：建立用流式细胞术检测人外周血中性粒细胞（polymorphonuclear cells,PMN）产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）的方法。方法：健康人外周全血或用Percoll分离的PMN,加探荧光针双氢罗丹明123（DHR123）或2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作用15 min,再加佛波醇酯（phorbo 12-myristate 13-acetate,PMA）于37℃作用5－90 min后,用流式细胞仪检测PMN内的罗丹明123（rhodamine 123,RHO）或氧化型二氯荧光素（dichlorofluorecin,DCF）的荧光强度,以反映PMN内ROS产生的水平。结果：以DHR123为荧光探针时,PMA刺激全血或分离PMN产生ROS的时间动力学相似,在37℃作用5－60 min ROS量呈递增趋势,且在60 min左右达到峰值,60－90 min时渐下降。以DCFH-DA为荧光探针时,PMA刺激全血PMN产生ROS,在37℃作用5 min时反应生成ROS量达到峰值,随后出现明显递减趋势,而PMA刺激分离PMN产生ROS在5－30 min逐渐增高并在60－90 min达平台期。实验中还发现甲醛试剂可以降低RHO的荧光强度。结论：采用流式细胞术检测PMN产生ROS是一种简便、可靠、稳定的方法。