双氧化酶成熟因子2基因检测在肺癌患者淋巴结转移及预后预测中的价值研究

目的:研究双氧化酶成熟因子2(DUOXA2)基因在肺癌患者肿瘤组织中的表达,以及其与肺癌患者临床病理特征和预后的相关性。方法:选取90例接受手术治疗的肺癌患者,通过定量PCR检测肺癌肿瘤组织和癌旁正常组织中DUOXA2 mRNA表达,通过免疫印迹法和免疫组织化学法检测DUOXA2蛋白表达,通过多因素回归分析法分析肺癌患者预后相关因素。结果:DUOXA2 mRNA和蛋白在90例肺癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。DUOXA2蛋白在肺癌肿瘤组织中的表达水平与肺癌患者年龄、性别、病理类型、肿瘤大小和TNM分期无关(均P>0.05),而与淋巴结是否转移有关(P<0.05);DUOXA2 mRNA和蛋白在30例淋巴结转移肺癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于其在60例淋巴结未转移肺癌患者肿瘤组织中的表达水平。多因素回归分析结果显示:DUOXA2在肺癌患者肿瘤组织中的表达水平是影响肺癌患者预后的独立危险因素(P=0.039)。结论:DUOXA2基因在肺癌患者肿瘤组织中表达升高,其表达水平与肺癌患者是否出现淋巴结转移有关,是影响肺癌患者预后的独立危险因素。

原癌基因c-erbB2和c-myb经丝裂原活化蛋白激酶和成熟促进因子途径调节卵母细胞的成熟

本研究探讨了原癌基因c-erbB2和c-myb对小鼠卵母细胞成熟的影响及其在调控卵母细胞成熟中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的上下游关系。c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)和c-mybASODN均呈剂量依赖方式抑制卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率和第一极体(first polar body,PB1)排放率,并显著延迟其成熟时间。小鼠卵母细胞显微注射重组人c-erbB2蛋白和c-myb蛋白后,培养6h其GVBD率分别比对照组上升了23.1%(P<0.05)和32.2%(P<0.05),培养12h其PB1排放率分别比对照组上升了17.3%(P<0.05)和23.5%(P<0.05)。RT-PCR结果显示,小鼠卵母细胞中存在c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达;c-erbB2ASODN能明显抑制卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA的表达,c-mybASODN能明显抑制卵母细胞中c-mybmRNA的表达,对c-erbB2mRNA无明显影响;MAPK抑制剂PD98059以及MPF抑制剂roscovitine在抑制卵母细胞成熟的同时,均能阻断显微注射重组人c-erbB2蛋白和重组人c-myb蛋白对卵母细胞成熟的促进作用,但对卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达无明显影响。Westernblot结果显示,c-erbB2ASODN、c-mybASODN、PD98059、roscovitine均使卵母细胞中MAPK磷酸化水平和cyclinB1含量下降。结果提示,原癌基因c-erbB2、c-myb在卵母细胞成熟中起重要作用,可能是调控卵母细胞成熟中关键蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物。

细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用

构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。

表皮生长因子对PC-3细胞环氧化酶-2表达的影响

目的:探讨表皮生长因子(EGF)对人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞环氧化酶-2(COX-2)表达的影响及可能的机制。方法:以1、10、100μg/L不同浓度的EGF作用于PC-3细胞24h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot测定COX-2的表达变化;再将磷脂酰肌醇-3激酶阻断剂(LY294002,20μmol/L)、促分裂原活化蛋白激酶阻断剂(SC203580,20μmol/L)和表皮生长因子受体阻断剂(ZD1839,2μmol/L)分别与10μg/LEGF作用于PC-3细胞,Western blot测定C0X-2蛋白的变化。结果:PC-3细胞在1～100μg/L浓度的EGF刺激以后的表达显著上调,和对照组有明显区别(P<0.05)。SC203580、LY294002和ZD1839显著抑制COX-2上调(P<0.05)。结论:EGF可诱导PC-3细胞COX-2的表达上调,促分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶参与了其中的调节过程。

胃癌组织血小板衍化内皮细胞生长因子、环氧化酶2的表达与血管生成和细胞凋亡的关系

目的:探讨血小板衍化内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)和环氧化酶2 (Cox-2)在胃癌组织中的表达及与血管生成和细胞凋亡的关系. 方法:应用免疫组化技术对67例胃癌组织进行PD-ECGF、Cox-2及肿瘤组织微血管密度(microvascular density, MVD)检测,流式细胞术检测胃癌细胞凋亡指数(apoptosis index,AI). 结果:PD-ECGF的表达与胃癌淋巴结转移(P<0.05)、分化程度(P<0.05)及组织分型(P<0.05)显著相关,Cox-2的表达与胃癌淋巴结转移(P<0.01)显著相关;二者与MVD (P<0.01)显著正相关,与AI(P<0.01)显著负相关,二者共同表达阳性者MVD显著高于共同表达阴性者(P<0.01), 二者共同表达阳性者AI显著低于共同表达阴性者(P<0.01). 结论:胃癌组织中PD-ECGF和Cox-2可促进血管生成, 抑制胃癌细胞凋亡,二者起协同作用,促进胃癌的增生与转移.

脂多糖对人胃癌细胞环氧化酶-2基因启动子活性的影响

目的研究炎症状态下人胃癌细胞中环氧化酶-2(COX-2)基因启动子活性。方法采用免疫组织化学染色方法观察人胃癌组织中COX-2的表达情况。构建人COX-2基因启动子重组质粒pGL3-COX-2-promoter,采用脂质体介导转染法将重组质粒和内参质粒pRL-TK共转染胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823。以不同质量浓度的脂多糖(LPS)工作液刺激细胞,于干预后不同时间点收集细胞,利用双荧光报告系统进行双荧光素酶报告基因活性检测,Western blotting检测COX-2蛋白的表达。结果免疫组织化学染色观察发现,胃癌癌细胞胞质及癌旁黏膜上皮细胞的胞质中均有COX-2蛋白表达。在相同时间点,SGC-7901和BGC-823内COX-2基因启动子活性随LPS质量浓度的上升而增高(P<0.05);高浓度(10μg/mL)LPS刺激6 h后COX-2基因启动子活性达到峰值,随后逐渐降低(P<0.05)。Western blotting检测结果显示:在10μg/mL LPS干预下,SGC-7901和BGC-823内COX-2蛋白表达随LPS干预时间的延长而呈现上升趋势。结论炎症刺激可激活人胃癌细胞COX-2基因启动子的表达活性。

环氧化酶-2、血管内皮细胞生长因子、热休克蛋白27和P53在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的通过对中国人非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织中环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、热休克蛋白27(HSP27)和P53表达的检测,观察这4种蛋白质在NSCLC肿瘤组织中的表达情况,分析其与性别、年龄、病理类型、肿瘤细胞分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移的相关性,为临床判断和有效控制NSCLC提供有价值的参考。方法采用免疫组织化学法检测50例NSCLC患者肿瘤组织中COX-2、VEGF、HSP27和P53的表达,采用原位杂交法检测COX-2mRNA的表达。结果COX-2、VEGF、HSP27、P53单一指标阳性均与性别、年龄、组织学分类、肿瘤直径、N分期、肿瘤细胞分化程度无关。COX-2与淋巴结转移有关(偏相关系数为0.3237,P=0.028),而VEGF、HSP27、P53与淋巴结转移无关。COX-2和P53或COX-2和VEGF共同高表达在N2期的NSCLC中明显多于N0和N1期;COX-2、P53和VEGF共同高表达或其中两种蛋白质高表达在N2期的NSCLC中明显多于N0和N1期(P=0.002)。HSP27高表达虽然与淋巴结转移无关,但与COX-2高表达有关(偏相关系数为0.5143)。结论COX-2、P53和VEGF共同高表达或其中两种蛋白质高表达与NSCLC淋巴结转移密切相关。COX-2与NSCLC淋巴结转移有关。

PPAR-γ2基因-C34G、NADPH氧化酶p22phox亚基基因-C242T多态性与幽门螺杆菌感染的交互作用和食管鳞状细胞癌的关系

目的探讨过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ2（PPAR-γ2）基因-C34G、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶p22phox亚基基因-C242T多态性与幽门螺杆菌（H.Pylori）感染的交互作用和食管鳞状细胞癌（ESCC）的关系。方法选择我院2010年5月~2015年3月收治的ESCCBroderⅠ级、BroderⅡ级和BroderⅢ级患者各200例,以200例健康体检者作为对照组,以上述各组患者的外周血白细胞为样本,利用PCR-RFLP检测PPAR-γ2基因-C34G和NADPH氧化酶p22phox亚基基因-C242T多态性。采用14C-UBT检测受检者H.Pylori与14C结合的每分钟衰变数（DPM）以判断H.Pylori感染情况。采用非条件Logistic回归对-C34G、-C242T多态性与H.Pylori感染的交互作用进行分析。结果 -C34G（CG）和-C34G（GG）基因型者患ESCC的风险均显著增加,-C242T（CT）和-C242T（TT）基因型者患ESCC的风险也显著增加。基因突变的协同分析发现-C34G（GG）和-C242T（TT）基因型在ESCC发生、发展存在正向的交互作用,另外在-C34G（CG）和-C242T（TT）之间、-C34G（CG）和-C242T（CT）之间及-C34G（GG）和-C242T（CT）之间均存在正向交互作用（γ均大于1）。H.Pylori感染者患ESCC的风险性均明显增高。H.Pylori感染与-C34G（CG）、-C34G（GG）、-C242T（CT）和-C242T（TT）基因型与均有正向交互作用（γ均大于1）。结论携带-C34G（CG）、-C34G（GG）、-C242T（CT）和-C242T（TT）基因型的个体属ESCC高危险人群,这些基因型和H.Pylori感染的交互作用促进了ESCC的发生、发展,应当采取根除H.Pylori或调控基因表达的措施以达到有效预防LSCC的目的。

POK红骨髓性致癌因子和鼠双微基因2蛋白在大鼠肺鳞状细胞癌发生中的表达及意义

目的探讨POK红骨髓性致癌因子(Pokemon)和鼠双微基因2(MDM 2)蛋白在大鼠肺鳞状细胞癌发生、发展中的关系及意义。方法 90只大鼠分为实验组75只和对照组15只,通过建立大鼠不同阶段肺组织鳞状细胞癌模型,采用免疫组织化学法检测肺鳞状细胞癌、癌前病变及正常肺组织中Pokemon和MDM 2蛋白的表达。结果 Pokemon和MDM 2蛋白从正常组织到鳞状细胞癌呈现逐渐增高的趋势。对照组的Pokemon和MDM 2蛋白表达与增生组比较差别无统计学意义(P>0.05),但低于非典型增生组及鳞状细胞癌组,差别有统计学意义(P<0.05);鳞状细胞癌组的Pokemon和MDM 2蛋白表达明显高于增生组和非典型增生组,差别有统计学意义(P<0.05)。转移癌组的Pokemon和MDM 2蛋白表达高于非转移癌组,差别有统计学意义(P<0.05)。Pokemon与MDM 2蛋白表达呈正相关(r=0.692,χ2=43.080,P<0.05)。结论 Pokemon和MDM 2蛋白在大鼠正常肺组织到肺鳞状细胞癌组织的演变过程中表达逐渐增高,Pokemon和MDM 2蛋白可能共同参与了肺癌的发生、发展和转移过程。

心肌缺血预适应环氧化酶-2、血管内皮因子的表达及其远隔器官效应

目的:探讨环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)在晚期缺血预适应(DPC)心肌及远隔器官(RPC)肝脏中的表达。方法:新西兰兔20只,随机分为DPC组及正常对照组,每组各10例。结扎兔冠状动脉左前降支建立缺血预适应模型,24h后取心肌及肝脏组织,免疫组化法测定心肌及肝脏COX-2、VEGF表达。结果:兔DPC心肌及肝脏COX-2、VEGF表达量比对照组明显增强,差异有显著性(P<0.05)。心肌非缺血区与对照组表达有显著差异性(P<0.05)。结论:缺血缺氧可刺激心肌COX-2、VEGF表达明显增强,心肌非缺血区及远隔器官肝脏也大量表达,COX-2、VEGF可能是参与抗缺血、冠状动脉侧枝血管形成及远隔器官保护效应中的重要物质。

大蒜素对结肠癌Lovo细胞端粒酶活性、环氧化酶-2及核因子-κB的影响

目的 探讨大蒜素对结肠癌细胞的作用机制。方法 采用不同浓度的大蒜素处理结肠癌Lovo细胞后 ,分别应用四唑盐比色试验、端粒重复扩增微孔板杂交法、RT PCR和Westernblot方法检测环氧化酶 2mRNA和蛋白水平的表达 ,采用凝胶迁移率法检测核因子 κB活性。结果 大蒜素对结肠癌Lovo细胞增殖具有较强的抑制作用。大蒜素能够抑制端粒酶活性 ,且这种作用呈浓度及时间依赖。同时发现 ,大蒜素能抑制环氧化酶 2mRNA和蛋白水平的表达及抑制核因子 κB活性。结论 大蒜素能够抑制结肠癌细胞的恶性增殖 ,其机制与抑制端粒酶活性、抑制环氧化酶 2基因的表达及抑制核因子

双棘黄姑鱼IGF2基因克隆及其在卵巢发育中的作用研究

运用RT-PCR和RACE技术,首次克隆了双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)的IGF2 cDNA。双棘黄姑鱼IGF2cDNA全长842bp,其中开放阅读框为648bp,5′非翻译区为125bp,3′非翻译区为69bp。IGF2前体mRNA编码215个氨基酸,成熟肽为71个氨基酸残基的多肽。多重氨基酸比对结果显示,双棘黄姑鱼与其他鱼类IGF2氨基酸序列高度保守。同源性分析表明,双棘黄姑鱼IGF2氨基酸序列与同属鲈形目的斜带石斑鱼、金头鲷、罗非鱼同源性分别为95.8%、95.3%和91.2%。系统进化树结果与同源性分析结果相似,双棘黄姑鱼IGF2基因首先与同属鲈形目的斜带石斑鱼、金头鲷、罗非鱼类聚,再与虹鳟、牙鲆、黄颡鱼的IGF2和斑马鱼IGF2b基因聚为一支,最后与斑马鱼IGF2a类聚为鱼类IGF2基因。组织分布结果表明,IGF2基因在双棘黄姑鱼各组织中表达广泛。RT-PCR结果显示,双棘黄姑鱼卵巢成熟期和退化期的IGF2表达量显著高于发育期,推测IGF2的表达可能促进了双棘黄姑鱼卵巢的成熟。

LncRNA TUG1介导Nrf2/HO-1信号通路对脂多糖诱导的心肌细胞凋亡的影响

目的 探究长链非编码RNA(LncRNA)牛磺酸上调基因(TUG)1介导核因子E2相关因子(Nrf)2/血红素氧化酶(HO)-1信号通路对脂多糖诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法 检测脂多糖诱导的心肌细胞中LncRNA TUG1表达量,将生长期脂多糖诱导的心肌细胞分为对照组、上调组、下调组。对照组不做处理,上调组做LncRNA TUG1上调质粒转染,下调组做LncRNA TUG1沉默质粒转染。鉴定LncRNA TUG1转染效率,分析调控LncRNA TUG1对脂多糖诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激、炎性反应及Nrf2/HO-1通路蛋白表达量的影响。结果 与对照组相比,上调组LncRNA TUG1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)表达量、凋亡率、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著上升,Bcl-2、Nrf2、HO-1表达量、超氧化物歧化酶(SOD)水平显著下降,下调组LncRNA TUG1、Caspase-3、Bax表达量、凋亡率、LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平显著下降,Bcl-2、Nrf2、HO-1表达量、SOD水平显著上升(P<0.05)。结论 脂多糖诱导的心肌细胞经下调LncRNA TUG1干预后凋亡率下降,氧化应激、炎性反应缓解,其机制可能与Nrf2/HO-1信号通路激活有关。

转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究

目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。

双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响。方法运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3′UTR(LATS2-3′UTR-WT)及突变型3′UTR(LATS2-3′UTR-MU)片段,构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化。结果Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3′UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3′UTR-MU+miR-31组相比,LATS2-3′UTR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03vs.1.00±0.03,P>0.05),而LATS2-3′UTR-MT+miR-31组与LATS2-3′UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02vs.1.00±0.03,P<0.01);AngⅡ诱导48h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P<0.01)及β-MHC表达上调(P<0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P<0.01),LATS2基因明显下调(P<0.05),96h后心肌细胞表面积明显增大。结论miR-31可通过与LATS2基因3′UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大。

多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因

鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。从双片段连接物中筛选出上百个菌落,经检测和序列测定,得到一个序列完全准确的克隆。对于难以直接克隆的长基因,可先扩增其各个片段,再将它们拼接成完整基因。其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,再辅以重叠延伸PCR融合法,即可实现多个基因片段的正确拼接。

CerbB-2基因、COX-2基因在鼻咽癌中的表达及相关性研究

目的探讨表皮生长因子受体-2(CerbB-2)基因、环氧化酶-2(COX-2)基因在鼻咽癌组织中的表达情况及两者间的相关性。方法采用免疫组化SP法检测CerbB-2、COX-2基因在90例鼻咽癌组织和22例鼻咽炎性组织中的表达情况。结果鼻咽癌组织中CerbB-2、COX-2基因表达的阳性率分别为65.56%和67.78%,鼻咽炎性组织分别为31.82%和36.36%,差异有统计学意义(P<0.05);在鼻咽癌组织中两者表达呈正相关(r=0.526,P<0.01)。结论CerbB-2、COX-2基因在鼻咽癌中以高表达方式存在,它们在鼻咽癌中的表达呈正相关,并且有可能通过共同高表达来促使鼻咽癌的发生、发展,而它们共同作用的机制有待进一步研究。

有甲状腺大的先天性甲状腺功能减退症患儿双氧化酶成熟因子1基因突变研究

目的对山东地区有甲状腺大的先天性甲状腺功能减退症（congenital hypothyroidism，CH）患儿双氧化酶成熟因子1（DUOXA1）基因进行突变筛查，阐明DUOXA1基因突变类型及特点，为CH的基因诊断及治疗提供理论依据。方法通过山东省新生儿筛查系统选取山东省52例有甲状腺大的CH患儿及100例健康对照者，抽取外周静脉血，提取白细胞全基因组DNA，采用8对序列特异性引物，运用PCR扩增与直接测序法对DUOXA1基因的全部编码序列（codingsequence，CDS）进行突变筛查。测序结果与DUOXA1基因的美国国立生物技术信息中心参考序列：NG_033105．1进行比对，并对发现的单核苷酸多态性（single nucleotide polymor—phisms，SNP）位点的基因频率进行，检验。结果在52例有甲状腺大的CH患儿及100例健康对照CDS区序列中均未发现突变，但在9例患儿及11例健康对照中的第7外显子发现1个SNP位点（rs75981505，c．398G〉T）为错义突变，导致密码子由CGC突变为CTC，相应133位氨基酸由精氨酸变为组氨酸（p．Arg133His）。2组SNP基因频率比较，差异无统计学意义（17．3％比11．0％,x^2=1．24，P〉0．05）。结论DUOXA1基因在山东地区有甲状腺大CH患儿突变率低，可能不是该地区伴甲状腺大CH患儿的主要病因。

COX-2和VEGF-C基因在乳腺良恶性病变中的表达研究

目的研究COX-2和VEGF-C mRNA在乳腺良恶性病变中的表达情况,探讨两者在乳腺肿瘤发生过程中的相互关系。方法运用Real-time PCR方法对90例乳腺良恶性病变组织中COX-2和VEGF-C mRNA的表达进行检测。结果 8例副乳腺组织中,COX-2和VEGF-C mRNA不表达或低表达,15例腺病和16例纤维腺瘤中两者表达明显增加(P<0.05),11例DCIS中,两者均高表达,高于腺病和纤维腺瘤(P<0.05),40例IDC中,两者同样高表达,并且肿瘤级别越高,表达水平越高。在DCIS和IDC中,两者表达存在正相关关系(分别r=0.82,P=0.002;r=0.89,P=0.000)。结论 COX-2和VEGF-C基因在乳腺良恶性病变中表达明显增高,而且在恶性肿瘤中的表达高于良性肿瘤,两者在乳腺癌组织中的表达呈正相关,表明两者参与了乳腺疾病,尤其是乳腺癌发生、发展的过程。

MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响

目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C>T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P<0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356^-108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1生成;预测发现正常MEF2C基因启动子片段上存在2个CpG岛,2个突变组预测没有发现CpG岛数目的变化,但位置发生变化。结论 MEF2C基因启动子区M1突变、M2突变均能提高转录活性,这2种突变导致启动子区转录因子结合位点数目、CpG岛位置的改变,这些变化可能与新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病的发病机制有关。